冠状动脉粥样硬化性心脏病患者肠道菌群丰度与血脂和血尿酸水平的相关性

王 超，袁 宇

(新乡医学院第一附属医院心血管内科，河南 卫辉 453100)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)是造成人类死亡的主要原因之一。近年来研究发现，肠道菌群失调与CAHD、高血压、心力衰竭、慢性肾脏疾病、2型糖尿病、脑梗死、肥胖等疾病有关[1-3]，肠道菌群丰度与血脂水平相关[4]。胡海兵等[5]研究发现，CAHD受试者较非CAHD受试者肠道致病菌数目增多，有益菌数目减少。任科雨等[6]对青岛市高尿酸血症受试者肠道菌群的研究显示，粪便菌群的尿酸(uric acid，UA)处理能力与乳酸杆菌及双歧杆菌含量有关。但目前血脂、血UA水平与CAHD患者肠道菌群丰度的关系尚不明确。本研究通过高通量测序方法探讨CAHD患者肠道菌群丰度与血脂、血UA水平的关系，旨在为CAHD的诊治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2016年9月至2017年11月新乡医学院第一附属医院心血管内科收治的疑似CAHD且行冠状动脉造影检查者106例为研究对象，受试者均为豫北居民，且满足以下条件：(1)无消化道手术史及器质性病变；(2)无肝肾疾病；(3)无心血管疾病史；(4)无感染；(5)无酗酒史；(6)1个月以内未使用任何影响肠道菌群及血脂的药物；(7)无糖尿病及致肠道菌群失调的其他问题。所有受试者根据冠状动脉造影结果进行分组，其中冠状动脉造影显示左主干、前降支、回旋支、右冠状动脉至少有1支或其大分支内径狭窄≥50%者列为CAHD组，其余列为对照组。CAHD组68例，男54例，女14例，年龄37～75(60.23±11.26)岁；体质量指数(body mass index，BMI)18.5～23.9(26.84±3.15)kg·m-2；高血压50例，有吸烟史47例。对照组38例，男30例，女8例，年龄33～71(61.55±10.99)岁；BMI 18.5～23.0(26.26±3.64)kg·m-2；高血压28例，有吸烟史26例。2组受试者年龄、性别、BMI、高血压、吸烟史比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试对象均知情并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器血脂、血UA测定试剂(北京九强生物技术股份有限公司)，细菌DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，MetaVxTM文库构建试剂盒(美国GENEWIZ公司)；全自动生物化学分析仪(日本日立公司)，Qubit 2.0 Fluorometer(美国Invitrogen公司)，Agilent 2100 生物分析仪(美国Agilent Technologies公司)，Illumina MiSeq高通量测序平台(美国Illumina公司)。

1.3 2组受试者血脂和血UA水平检测2组受试者均于入院次日清晨空腹抽取肘静脉血10 mL，使用全自动生物化学分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)及UA水平。

1.4 粪便采集及肠道菌群DNA提取2组受试者均于治疗前收集新鲜粪便样本，每人5 g，置于清洁干燥粪便收集管，封口后于冰盒保存，5 h内提取样本总DNA，并置于-80 ℃冰箱保留，使用北京天根生化科技有限公司的细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA。

1.5 肠道菌群的高通量测序由GENEWIZ(苏州)公司采用Illumina MiSeq平台进行测序和高通量测序文库的构建。双端测序得到的正反向reads首先进行两两组装连接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留序列长度>200 bp的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于可操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)分析，使用VSEARCH(1.9.6)进行序列聚类(序列相似性设为97%)，比对的16S rRNA参考数据库为 Silva 123。对代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。使用ANOVA法计算CAHD组与对照组在不同分类层次上菌群的丰度差异。

2 结果

2.1 2组受试者血脂及血UA水平比较结果见表1。与对照组受试者比较，CAHD组受试者血清UA、TC、LDL水平显著升高，HDL水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；2组受试者血清TG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组受试者血清血脂及血尿酸水平比较

组别nUA/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)对照组38311.56±63.181.68±0.213.64±0.531.75±0.242.26±0.51CAHD组68374.64±56.16a1.06±0.10a4.72±0.85a1.81±0.312.84±0.43a

注：与对照组比较aP<0.05。

2.2 2组受试者肠道菌群丰度比较

2.2.1 2组受试者肠道菌群门水平丰度比较结果见表2。2组受试者肠道菌群在门水平上共检测到拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门、放线菌门、软壁菌门、互养菌门、广古菌门8个菌门。与对照组相比，CAHD组受试者拟杆菌门细菌丰度减小，厚壁菌门细菌丰度增加，差异有统计学意义(P<0.05)；2组受试者变形菌门、梭杆菌门、放线菌门、软壁菌门、互养菌门、广古菌门细菌丰度比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组受试者拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门的检出率均为100%；对照组梭杆菌门、软壁菌门、互养菌门、广古菌门检出率分别为57.9%(22/38)、13.2%(5/38)、13.2 %(5/38)、5.3%(2/38)，CAHD组受试者梭杆菌门、软壁菌门、互养菌门、广古菌门检出率分别为58.8%(40/68)、14.7%(10/68)、11.8 %(8/68)、5.9%(4/68)，2组受试者梭杆菌门、软壁菌门、互养菌门、广古菌门检出率比较差异均无统计学意义(χ2=0.009、0.000、0.000、0.000，P>0.05)。

表2 2组受试者肠道菌群门水平丰度比较

组别n丰度拟杆菌门厚壁菌门变形菌门梭杆菌门放线菌门软壁菌门互养菌门广古菌门对照组3822264.8±1203.211583.4±926.1 3064.2±101.51562.4±66.9468.4±72.529.8±5.316.2±5.93.7±0.4CAHD组6814472.8±1041.3a17590.9±1154.8a2526.3±85.71354.5±73.5396.3±64.132.2±6.713.4±1.12.6±0.2

注:与对照组比较aP<0.05。

2.2.2 2组受试者肠道菌群纲水平丰度比较结果见表3。2组受试者肠道菌群均检测到15个菌纲。CAHD组受试者的β-变形菌纲细菌丰度小于对照组，梭菌纲细菌丰度大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组受试者β-变形菌纲、梭菌纲细菌检出率均为100%。

表3 2组受试者肠道菌群纲水平丰度比较

组别n丰度梭菌纲β-变形菌纲对照组387270.2±312.4855.3±82.7CAHD组6813868.6±1085.7a245.5±34.5a

注:与对照组比较aP<0.05。

2.2.3 2组受试者肠道菌群目水平丰度比较结果见表4。2组受试者肠道菌群均检测到19个菌目。其中CAHD组受试者拟杆菌目、Burkholderiales目、双歧杆菌目、乳酸杆菌目细菌丰度小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组受试者拟杆菌目、Burkholderiales目、双歧杆菌目、乳酸杆菌目细菌检出率均为100%。

表4 2组受试者肠道菌群目水平丰度比较

组别n丰度拟杆菌目Burkholderiales目双歧杆菌目乳酸杆菌目对照组3821358.1±917.6834.6±58.1752.8±84.7256.4±52.4CAHD组6813911.6±843.5a243.3±46.9a333.6±73.1a162.6±62.4a

注:与对照组比较aP<0.05。

2.2.4 2组受试者肠道菌群科水平丰度比较结果见表5。2组受试者肠道菌群均检测到35个菌科。其中CAHD组受试者消化链球菌科、Erysipelotrichaceae科细菌丰度大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组受试者消化链球菌科、Erysipelotrichaceae科细菌检出率均为100%。

表5 2组受试者肠道菌群科水平丰度比较

Tab.5 Comparison of bacterial family-abundance between the two groups

组别n丰度消化链球菌科Erysipelotrichaceae科对照组3856.2±6.310.2±1.1CAHD组6884.2±8.9a133.8±22.4a

注:与对照组比较aP<0.05。

2.2.5 2组受试者肠道菌群属、种水平丰度比较结果见表6。2组受试者肠道菌群均检测到99个菌属。其中CAHD组受试者拟杆菌属、Roseburia属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属细菌丰度小于对照组(P<0.05)，Blautia属、Odoribacter属、Ruminococcus-2属、Faecalibacterium属、Alistipes属、Subdoligranulum属、埃希氏菌属、Stercoris种细菌丰度大于对照组(P<0.05)。2组受试者中Blautia属、拟杆菌属、双歧杆菌属、Faecalibacterium属、Subdoligranulum属、埃希氏菌属检出率均为100.0%；对照组Odoribacter属、玫瑰单胞菌属、Ruminococcus-2属、Alistipes属、乳酸杆菌属检出率分别为81.6%(31/38)、94.7%(36/38)、100.0%(38/38)、92.1%(35/38)、55.3%(21/38)；CAHD组Odoribacter属、玫瑰单胞菌属、Ruminococcus-2属、Alistipes属、乳酸杆菌属检出率分别为63.2%(43/68)、94.1%(64/68)、98.5%(67/68)、66.2%(45/68)、60.3%(41/68)；2组受试者中玫瑰单胞菌属、Ruminococcus-2属、乳酸杆菌属检出率比较差异均无统计学意义(χ2=0.000、0.000、0.009，P>0.05)；CAHD组受试者Odoribacter属、Alistipes属细菌检出率小于对照组(χ2= 3.892、8.853，P<0.05)。

表6 2组受试者肠道菌群属、种丰度比较

细菌类别丰度对照组(n=38)CAHD组(n=68)Blautia属24.6±6.2290.0±20.5aOdoribacter属169.6±31.8205.4±54.7a拟杆菌属18237.4±1361.29374.7±617.3a玫瑰单胞菌属1481.4±106.4914.3±87.6a双歧杆菌属752.8±64.1333.6±36.7aRuminococcus-2属93.5±11.7889.2±76.4aFaecalibacterium属1274.2±178.92865.6±213.5aAlistipes属741.2±41.41536.1±183.8aSubdoligranulum属416.5±63.01024.2±100.1a埃希氏菌属54.6±4.9378.7±69.9a乳酸杆菌属5.9±0.83.1±0.3aStercoris种33.0±4.168.0±6.7a

注:与对照组比较aP<0.05。

2.3 血UA、TG、HDL及LDL水平与肠道细菌丰度的相关性结果见表7。2组受试者血UA水平与双歧杆菌目、乳酸杆菌属细菌丰度呈负相关(r=-0.562、-0.112、-0.429、-0.045，P<0.05)，与埃希氏菌属细菌丰度成正相关(r=0.781、0.193，P<0.05)，此相关性在CAHD组更显著；CAHD组受试者血UA水平与Burkholderiales目细菌丰度呈正相关(r=0.716，P<0.05)，与乳酸杆菌目细菌丰度呈负相关(r=-0.687，P<0.05)；但对照组UA水平与Burkholderiales目、乳酸杆菌目无相关性(r=0.658、0.562，P>0.05)。2组受试者血TG水平与拟杆菌目、Odoribacter属细菌丰度呈负相关(r=-0.761、-0.354、-0.323、-0.256，P<0.05)，与梭菌纲细菌丰度呈正相关(r=0.867、0.447，P<0.05)；CAHD组受试者血TG水平与Stercoris种细菌丰度呈正相关(r=0.258，P<0.05)。2组受试者血HDL水平与消化链球菌科、梭菌纲细菌丰度呈正相关(r= 0.650、0.146、0.597、0.012，P<0.05)，CAHD组受试者血HDL水平与软壁菌门细菌丰度呈正相关(r=0.656，P<0.05)。2组受试者血LDL水平与消化链球菌科、梭菌纲细菌丰度均呈负相关(r= -0.497、-0.036、-0.839、-0.181，P<0.05)，此相关性在CAHD组更显著。

表7 血UA、TG、HDL及LDL水平与肠道菌群丰度的相关性

Tab.7 Correlation between blood UA，TG，HDL，LDL levels and gut flora abundance

血液学指标肠道菌群对照组(n=38)rPCAHD组(n=68)rPUABurkholderiales目0.6580.4210.7160.041双歧杆菌目-0.1120.006-0.5620.028乳酸杆菌目0.5620.145-0.6870.014乳酸杆菌属-0.0450.016-0.4290.013埃希氏菌属0.1930.0410.7810.016TG梭菌纲0.4470.0120.8670.036拟杆菌目-0.3540.037-0.7610.023Odoribacter属-0.2560.031-0.3230.043Stercoris种-0.5440.2540.2580.028HDL软壁菌门-0.5220.2650.6560.045梭菌纲0.0120.0140.5970.034消化链球菌科0.1460.0320.6500.023LDL梭菌纲-0.1810.043-0.8390.013消化链球菌科-0.0360.028-0.4970.035

3 讨论

CAHD为最常见的心血管疾病，发病率呈逐年增加的趋势，发病年龄趋于低龄化[7]。目前，CAHD的发病机制尚不完全清楚。血脂代谢异常、血UA异常与CAHD的发生、发展密切相关。1984年，有研究首次证明了降低TC和LDL胆固醇可以降低CAHD发病率和病死率[8]，血脂异常是CAHD的首要危险因素。研究显示，HDL水平越低，CAHD风险越大[9]。袁宁等[10]研究发现，CAHD患者血UA水平与CAHD病变程度呈正相关，是反映冠状动脉病变严重程度的独立指标。研究显示，血脂异常是青年急性心肌梗死的独立危险因素[11]。本研究结果显示，CAHD组患者TC、LDL、UA水平较对照组显著增加，而HDL却显著下降。

成年人的肠道至少包含500种细菌微生物群，约含有1013到1014个微生物，肠道菌群失调与CAHD、高血压、心力衰竭、慢性肾脏疾病、2型糖尿病、肥胖等疾病相关[1]。有研究指出，肠道菌群通过参与调节宿主胆固醇代谢、UA代谢等基础代谢过程，从而影响CAHD的发生、发展[12]；胆碱、三甲胺氧化物(trimetlylamine oxide，TMAO)和甜菜碱3种肠道菌群代谢产物与心血管疾病风险相关。动物实验表明，脂质磷脂酰胆碱在肠道菌群作用下代谢产生三甲胺(trimethylamine，TMA)，TMA通过肝脏中的黄素单氧化酶转化为TMAO释放入血，改变胆固醇和胆汁酸的代谢，提高巨噬细胞的活性，从而加速动脉粥样硬化进程[13]。WANG等[13]、KUMMEN等[14]研究表明，TMAO可提高恶性心血管事件的发生率。2016年，王珊等[15]研究发现，TMAO与肠道菌群中的厌氧孢杆菌属、梭菌属、考拉杆菌属、颤杆菌克属及Alistipes属有相关性。KELLY等[16]研究证实，肠道菌群的丰度与心血管疾病的风险相关。本研究对比分析了CAHD组和对照组受试者的肠道菌群，发现2组受试者在2个门、2个纲、4个目、2个科、11个属的菌群丰度上存在显著差异，2组受试者肠道菌群的差异在拟杆菌门与厚壁菌门丰度上表现尤其明显；在非门水平上，与对照组相比，CAHD组受试者拟杆菌属、双歧杆菌属、双歧杆菌目、拟杆菌目、乳酸杆菌目等有益菌丰度明显降低；Ruminococcus-2属、Blautia属、Odoribacter属、梭菌纲、消化链球菌科、Erysipelotrichaceae科、Stercoris种等致病菌的丰度明显升高。此结果与胡海兵等[5]、CUI等[17]的结果不尽相同，这可能是由于研究对象的地域、饮食差异以及实验方法等所造成，但有益菌减少、致病菌增多的趋势未发生变化。

一项对893例受试者血脂与肠道菌群的相关性研究提示，巴斯德氏菌科、Coprococcus属、Collinsella属与TG水平呈显著相关，消化链球菌科、梭菌科与LDL水平呈显著正相关[4]。周雪[18]在瑞舒伐他汀降脂效果与人微生态菌群相关性研究中发现，应用瑞舒伐他汀后低脂组受试者的肠道菌群与高脂组相比在门、科、属水平上差异均有统计学意义。本研究显示，2组受试者血清HDL水平与消化链球菌科、梭菌纲细菌丰度均呈正相关；血清TG水平与拟杆菌目、梭菌属细菌丰度呈负相关，与梭菌纲细菌丰度呈正相关；2组受试者血清LDL水平与消化链球菌科、梭菌纲细菌丰度呈负相关；以上相关性在CAHD组更显著。另Stercoris种、软壁菌门在对照组中与血清HDL、LDL、TG水平无显著相关，但CAHD组受试者血TG水平与Stercoris种细菌丰度呈正相关，血HDL水平与软壁菌门细菌丰度呈正相关。以上结果提示肠道菌群在CAHD血脂调节中有重要作用。

王玲等[19]用荧光定量聚含酶链反应测定进行菌群分析，结果显示，CAHD组双歧杆菌及乳酸杆菌明显减少，而大肠杆菌、幽门螺杆菌、链球菌则明显增加，肠道细菌总负荷明显增加。关于CAHD受试者尿酸与肠道菌群相关性的研究显示，随着CAHD受试者血UA水平的升高，肠道大肠埃希菌、幽门螺旋杆菌等肠道机会致病菌也随之增加，而双歧杆菌、乳酸杆菌水平却下降[20]。熊文等[21]研究发现，乳酸杆菌与双歧杆菌在小鼠肠道各段的定植数与血液及消化液中尿素氮、肌酐和UA均呈明显负相关。本研究检测结果显示，2组受试者血UA水平与肠道双歧杆菌目、乳酸杆菌属细菌丰度均呈负相关，与埃希氏菌属细菌丰度呈正相关，与以上研究相一致，提示CAHD受试者肠道细菌与血UA水平有关。

综上所述，CAHD受试者与对照组的肠道菌群丰度在门、纲、目、科、属、种水平存在一定差异；肠道菌群与CAHD受试者血脂、血UA水平存在明显的相关性。肠道菌群有可能成为预防及治疗CAHD的新靶点，临床或可通过调节肠道菌群来控制血脂、血UA水平，进而控制CAHD的发生、发展。