亚胺培南联合8种抗菌药物对产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的体外联合药敏试验

郝 敏， 秦晓华

肺炎克雷伯菌属于肠杆菌科细菌，是常见的医院获得性病原菌。近年来，全球碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的出现和广泛传播成为一个亟待解决的公共卫生问题。我国细菌耐药监测网CHINET数据显示肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药率逐年攀升，至2017年已上升至23.1%[1]，较2005年耐药率上升约24倍。导致碳青霉烯类耐药的原因有多种，但产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的最主要的原因，其中又以KPC型碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniaecarbapenemase） 最为常见[2-3]。blaKPC基因通常位于可移动元件上，通过质粒在不同菌株间传播，耐药质粒上常携带多种耐药基因，使得其几乎对所有常用抗菌药物耐药，为临床治疗CRKP感染患者带来极大的挑战。

已有越来越多的文献报道表明联合使用抗菌药物可能对治疗CRKP感染有效。临床上也通常选用联合方案而不是单药来治疗CRKP感染[4-5]。碳青霉烯类抗生素通常不单独用于治疗，但与其他抗菌药物联合使用具有一定的协同作用。有研究表明，基于碳青霉烯类的联合方案治疗患者病死率明显低于不含有碳青霉烯类的联合方案，尤其是当菌株对碳青霉烯类耐药程度较低时[6]，较为常见的有碳青霉烯类与多黏菌素类、替加环素、磷霉素、利福平等联合应用[7]。但目前对于何种联合方案更加有效并没有一致的结论，本文应用棋盘法联合药敏和体外杀菌曲线方法评估目前常见联合应用方案以及其他潜在联合方案的体外杀菌效 果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 复旦大学附属华山医院2014－2015年分离的10株非重复的CRKP，均来自神经外科术后感染患者标本。其中9株分离自9例肺部感染患者的痰液标本，1株分离自1例中枢神经系统感染患者的脑脊液标本。10株非重复的肺炎克雷伯菌的美罗培南纸片法抑菌圈直径均≤19 mm，符合CDC 2015年关于碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）判定的标准[8]，即均为CRKP。进一步对10株CRKP菌株进行16S rRNA扩增复核鉴定[9]。

1.1.2 培养基和抗菌药物 药敏试验用英国OXOID公司阳离子调节Mueller-Hinton肉汤。抗菌药物纸片为英国OXOID公司商品。抗菌药物粉剂亚胺培南、美罗培南、厄他培南、黏菌素 、哌拉西林等为大连美伦公司标准品，庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、环丙沙星、甲氧苄啶、磺胺甲唑、替加环素、氨曲南、他唑巴坦、克拉维酸、利福平为国家卫健委食品药品鉴定研究所标准品。

1.2 方法

1.2.1 碳青霉烯酶的筛选 PCR法扩增碳青霉烯酶基因（KPC、NDM-1、VIM和IMP）。所用引物见参考文献[10]，阳性扩增产物送至上海迈浦生物科技有限公司使用3730XL测序仪进行Sanger法DNA测序，测序结果在NCBI GenBank网站上通过BLAST搜索引擎与标准序列进行比对确认以明确基因型别。

1.2.2 微量稀释法药敏试验 采用微量肉汤稀释法测定14种抗菌药物对10株CRKP的最低抑菌浓度（MIC）。其中甲氧苄啶-磺胺甲唑和哌拉西林-他唑巴坦为复合制剂、其余12种包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等在内的均为近年来临床沿用的抗菌药物。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922 。按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI） 2017年M100s-27th推荐的规范和折点实施试验和判读结果[11]。其中替加环素按照欧洲抗微生物药敏试验委员会（EUCAST）推荐的规范和折点实施试验和判读结果。替加环素对肠杆菌科细菌的MIC≤2 mg/L为敏感（S）、MIC≥8 mg/L 为耐药（R）[12]。

1.2.3 联合药敏 联合药敏组合方案为亚胺培南分别联合黏菌素、替加环素、头孢他啶、利福平、厄他培南、克拉维酸、环丙沙星、阿米卡星。棋盘法测试浓度范围为亚胺培南1/8 MIC～8MIC浓度，其余药物为1/32 MIC～32 MIC浓度。每孔分别加入2种联合用药的抗生素各12.5 μL，再加入以新鲜菌落制备0.5麦氏浊度的接种菌液，稀释102倍后菌液浓度为106cfu/mL的菌悬液25 μL，微孔板中的最终接种菌量为5×105cfu/ mL。37 ℃培养16～20 h，读取结果并记录单药和两药联合时MIC值[13]。

部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index， FIC）作为联合药敏试验结果的判断依据。FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单药+MIC乙药联合/MIC乙药单药。FIC≤0.5为协同作用，0.5＜FIC≤1为相加作用，1＜FIC≤2为无关作用，FIC＞2为拮抗作用[14]。

1.2.4 时间-杀菌曲线 挑取纯分菌落于2 mL肉汤中，35 ℃18 h过夜培养。将过夜培养的菌液调节至0.5麦氏浊度，再将其稀释102倍，摇床震荡1.5 h（t+0）h。分别选取联合方案FIC值最小时抗菌药物的浓度作为杀菌曲线药物浓度，在预先配置好药物浓度的肉汤中接种（t+0）h的菌液，使得初始浓度在106cfu/mL左右。37 ℃培养24 h，在（t+0、t+2、t+4、t+6、t+8、t+10、t+24）h 7个时间点取10 μL菌液进行适当稀释涂布平皿，进行菌落计数[13]。

2 结果

2.1 CRKP药敏试验的结果

10株CRKP对黏菌素的敏感率为100%，对替加环素的敏感率为80%；而对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、庆大霉素、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦的耐药率都达到100%；对阿米卡星、头孢他啶、环丙沙星和甲氧吡啶-磺胺甲唑的耐药率分别为80%、90%、80%和70%。

2.2 碳青霉烯酶的检测

10株CRKP经PCR扩增，blaKPC-2基因均为阳性，后扩增产物经DNA测序，与NCBI网站GenBank数据库比对后明确均为blaKPC-2碳青霉烯酶基因，其他碳青霉烯酶基因均未检出。

2.3 亚胺培南与黏菌素等联合药敏

棋盘法药敏结果显示，亚胺培南与黏菌素等8种抗菌药物对10株CRKP的体外联合抑菌试验显示均未发现有拮抗现象。但相比较而言，亚胺培南与厄他培南或与克拉维酸的联合抑菌效果最为显著，其与克拉维酸的联合对7株CRKP显示协同作用，对3株CRKP显示相加作用；其与厄他培南联合也有6株CRKP显示协同作用，另4株菌株显示无关作用。亚胺培南与头孢他啶或与利福平的联合，均有2株对CRKP显示有协同作用；其中与头孢他啶的联合对另8株CRKP具相加作用；而与利福平的联合显示对6株CRKP呈相加作用，2株呈无关作用。亚胺培南与黏菌素或与替加环素的联合虽未发现有拮抗现象，但亦无协同作用发生，两组联合均对其中的4株CRKP呈现相加作用，6株无关。亚胺培南与环丙沙星或与阿米卡星的两组联合，每组均仅有1株CRKP显示协同作用和1株为相加作用，另8株无关。见表1和表2。

表1 亚胺培南联合8种抗菌药物对10株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的药敏结果Table 1 Antimicrobial effect of imipenem in combination with another antibiotic against 10 strains of KPC-2 producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

2.4 亚胺培南与黏菌素等联合杀菌曲线

基于棋盘法体外联合抑菌试验的结果，菌株KPN2和KPN3对最多的联合方案表现出协同作用，因此选择菌株KPN2和KPN3进一步进行联合杀菌试验，了解亚胺培南和黏菌素等抗菌药物的联合杀菌效果。联合杀菌浓度选取亚胺培南与各抗菌药物的棋盘法药敏试验时，显示FIC值最小点的抗菌药物MIC值作为联合杀菌曲线试验中的药物浓度。结果显示，亚胺培南联合克拉维酸对受试菌KPN2的杀菌曲线显示亚胺培南在1/4 MIC与1/8 MIC的浓度，KPN3在亚胺培南1/4 MIC和1/16 MIC的浓度时分别在（t+2）h可达到99.9%或以上的杀菌率，此作用可维持至（t+6）h或（t+8）h；至（t+10）h，亚胺培南联合克拉维酸对两菌的杀菌率逐渐降低，细菌生长曲线有恢复上升的趋势。亚胺培南联合利福平对KPN2或联合头孢他啶对KPN3的杀菌曲线同样可显示90%或以上的杀菌率，此作用从（t+4）h开始可

维持至（t+10）h。上述所有的联合杀菌试验在培养至24 h后均出现了生长。而受试菌所有单药的生长曲线与无药的对照生长曲线同样呈平行上升趋势。见图1。

表2 亚胺培南联合克拉维酸、厄他培南对10株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的最小FIC值及结果Table 2 Minimum FIC values and the corresponding implication of imipenem in combination with clavulanic acid or ertapenem against 10 strains of KPC-2 producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

图1 体外杀菌曲线Figure 1 in vitro time-kill assay

3 讨论

本研究10株CRKP菌株，均来自于神经外科术后患者：9株来自于肺部感染患者痰标本，1株来自于中枢神经系统感染患者脑脊液标本。中枢神经系统感染患者在得到脑脊液培养CRKP结果后，一度用大剂量亚胺培南-西司他丁（1.0 g-1.0 g静脉滴注，1次/8h）联合头孢他啶（2.0 g静脉滴注，1 次/8 h）抗感染治疗1周，脑脊液白细胞数呈下降趋势，但其后再次出现脓性脑脊液，并出现癫痫发作，改为美罗培南联合多黏菌素B抗感染治疗，脑脊液白细胞数指标再次好转，然而最终因原发病加重和多脏器功能衰竭死亡。9例肺部感染患者中7例曾在病程中使用大剂量美罗培南（2.0 g，1次/8h）+替加环素（50 mg，1次/12 h），其中2例临床好转，3例死亡，2例转归不明。另2例肺部感染患者，在临床得到痰培养CRKP结果前自动出院，转归不明。由此可见，CRKP所致的医院感染，预后不佳，病死率高。临床上CRKP感染的治疗是非常严峻的挑战。

由于推荐用于治疗CRKP感染的药物十分有限，且价格昂贵[15]，针对治疗携带blaKPC-2的CRKP感染的头孢他啶-阿维巴坦尚未在我国上市，目前许多研究都在尝试寻找临床治疗CRKP感染的有效联合方案[16]。本研究的结果，部分与前期报道的结果不一致，部分研究表明亚胺培南与替加环素或多黏菌素E有较好协同作用[14]，本研究中，亚胺培南与黏菌素或与替加环素的联合方案在棋盘法药敏中并未显示出协同作用。但另有研究者在体外联合药敏试验中得出了与本试验相似的结果[17]，在体外试验中未发现亚胺培南与替加环素或与黏菌素的协同作用。这是否可能由于体内外药物分布与个体代谢的差异所导致，值得进一步研究。

由于利福平拥有可以渗透进细胞内和生物膜中的特性，本课题将其纳入联合方案中[18]。曾有报道黏菌素和利福平的联合使用对包含CRKP在内的多重耐药病原菌有协同作用[19]。本研究中亚胺培南和利福平的联合方案对部分菌株表现出协同作用。但以利福平联合治疗CRKP的方案在临床并不常用，疗效尚无法评估。值得注意的是，利福平会引起某些药物，如华法林、抗真菌药物等体内代谢水平的改变，所以临床上选择利福平联合方案需谨慎。

头孢他啶为半合成的第三代头孢菌素，对抗革兰阳性菌和阴性菌具有广谱抗菌作用，该抗菌药物适用于敏感革兰阴性杆菌所致的败血症、下呼吸道感染、腹腔胆系感染、复杂性尿路感染和严重皮肤及皮肤结构感染等。有研究表明头孢他啶与其他抗菌药物联合使用时，可有协同作用[20]。也有报道头孢他啶联合左氧氟沙星成功治疗产KPC酶的肠杆菌科细菌感染的案例[21]。本组资料显示亚胺培南与头孢他啶的联合对20%菌株有协同作用，并通过体外时间-杀菌曲线得到验证。表2中KPN3菌株来自于中枢神经系统感染患者脑脊液标本，临床资料显示该患者病程中曾采用该联合方案治疗，一度患者临床表现好转和脑脊液白细胞数下降至正常范围，但后期感染加重，故该方案的临床有效性尚需要进一步的研究证实。

有文献报道，碳青霉烯类抗生素中厄他培南对细菌产生的KPC酶最不稳定，极易为KPC酶水解。这可能是由于厄他培南与KPC酶之间存在较高的的亲和性[22]。正是由于这一特性，近年来厄他培南联合另一碳青霉烯类药物的方案（“双碳”方案）治疗产KPC酶CRKP感染的报道多见[23-24]。厄他培南以其尽可能多的结合KPC酶，使得另一碳青霉烯类药物可以发挥抗菌作用。本研究中，棋盘法体外抑菌试验结果显示了厄他培南和亚胺培南的联合具有良好的协同作用，但这一作用并没有在体外联合杀菌曲线中得到验证，这可能是由于样本量较小所导致。厄他培南和美罗培南联合治疗CRKP感染的疗效仍需进一步行体内外大样本量的研究。另外，需要指出的是厄他培南与亚胺培南同为碳青霉烯类药物，体外抑菌试验结果中的“协同”作用实为厄他培南发挥抑制KPC酶的作用，这与传统意义上的两类作用机制不同的抗菌药物联合使用时存在协同作用，即达到（1+1）＞2的效果，存在一定差异，即并非真正的协同作用。

克拉维酸作为一种“自杀性”细胞内和细胞外的β内酰胺酶抑制剂对大部分β内酰胺酶有良好的抑制效果。有少量证据表明，克拉维酸对KPC酶有抑制效果。有研究表明，以头孢他啶和克拉维酸作为联合方案，可以有效治疗产KPC酶的CRKP感染[20]。本研究中，亚胺培南和克拉维酸的联合棋盘法体外抑菌试验结果和杀菌曲线均显示该类联合对CRKP表现出了良好的协同抑菌和杀菌作用。提示亚胺培南联合克拉维酸可以作为临床治疗CRKP感染的可选药物之一。需要说明的是，克拉维酸为β内酰胺酶抑制剂，该药本身无抗菌活性，且在亚胺培南和克拉维酸的联合方案中，同样依靠克拉维酸对KPC酶的部分抑制作用而部分恢复亚胺培南对CRKP菌株的敏感性，有别于传统意义上的两种抗菌药物的协同作用。

本组资料虽显示所有的联合杀菌试验在细菌培养至24 h后均出现了生长，但这不代表具有临床相关性，因为在体外进行杀菌曲线试验时，抗菌药物为一次性给药，在实验中无法像临床治疗患者一样定时分次补充药物，以维持稳定的药物浓度。 尽管体外实验不能完全说明临床使用的效果，但本研究结果提示，亚胺培南联合头孢他啶、利福平或克拉维酸，可能为临床治疗CRKP引起的感染提供参考。