莲草直胸跳甲OBP51的克隆及表达分析

胡 军 ，付 丽 ，王亚茹 ，张 彬 ，刘艳红 ，贾 栋 ，马瑞燕

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801；3.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是全球入侵性杂草喜旱莲子草的专食性天敌，其已在世界范围内用于防治该恶性杂草[1-2]。目前，生物防治是最有效的防治手段[3]。昆虫通过触角辨别不同的气味实现定位寄主植物[4]，气味分子通过自由扩散进入昆虫触角淋巴液后，首先由气味结合蛋白（OBP）将其运输并穿过淋巴液，送达神经突触上的气味受体（OR），OR在收到气味分子后，产生神经冲动，实现化学信号与电信号的转换，并最终引起昆虫吸引、取食、逃避等行为反应[5-6]。因此，OBP能否携带特定的气味物质到达OR是昆虫能否识别气味分子的关键。

目前，已有多种昆虫OBP参与识别植物挥发物被报道。其中，草地螟（Loxostege sticticalis）OBP2对植物挥发性物质中含量最高的反式-2-依维派钠、顺式-3-己烯基乙酸盐有高的亲和力和强的电生理反应[7]；白背稻虱（Sogatella furcifera）OBP2、OBP11对水稻挥发物2-十三烷酮、β-紫罗兰酮有高亲和力[8]；苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）OBP10 对6种植物宿主挥发物月桂烯、β-蒎烯、β-紫罗兰酮、3- 己酮、（E）-2- 己烯醛、1- 己醇有高的亲和力[9]；中华蜜蜂（Apis cerana）OBP2、CSP3对花挥发物 β-紫罗兰酮均有高亲和力[10]；棉铃虫（Helicoverpa armigera）OBP17、OBP18对多种植物挥发物尤其是β-紫罗兰酮有高的亲和力[11]；绿盲蝽（Apolygus lucorum）的 3 种 OBP（OBP3、OBP4、OBP6）和一种化学感受蛋白CSP1对植物挥发物没有亲和力，但对大部分次生代谢产物均有较高的亲和力[12]；樟巢螟（Orthaga achatina）OBP2对植物挥发物法尼醇和法呢烯有高的亲和力[13]；华北大黑鳃金龟的2种OBP（OBP1、OBP2）均对植物挥发物有高的亲和力[14]。

本试验克隆莲草直胸跳甲OBP51全长cDNA序列，分析其序列特征，并利用定量PCR分析其在成虫不同组织中的相对表达量，旨在了解OBP51在莲草直胸跳甲气味识别过程中的作用，为进一步揭示莲草直胸跳甲专一取食喜旱莲子草的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

莲草直胸跳甲虫源来自山西农业大学生物安全与生物防治实验室长期饲养种群，在人工气候箱中饲养完成，饲养温度为25～27℃，光照条件为光照∶黑暗＝14 h∶10 h，湿度为85%。取食的喜旱莲子草为山西农业大学生物安全与生物防治实验室温室中常年种植。

PhusionRHigh-Fidelity DNA Polymerase购自NEB（伊普斯威奇，英国）；M-MLV反转录酶购自Promega（麦迪逊，美国）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2 OBP51全长基因克隆

表1 研究所用引物

取30头化蛹3 d的莲草直胸跳甲成虫触角，液氮研磨后用 TRIzol提取总 RNA；取 1 μg总RNA，用M-MLV反转录酶反转录成cDNA后用PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase进行全长序列扩增，PCR反应体系为cDNA模板1 μL，5×反应缓冲液 4 μL，引物 OBP51-F/R（表 1）各 1 μL，dNTP 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.2 μL，去离子水 12.3 μL。扩增程序为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃20 s，35个循环；72℃5 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行切胶回收，连接到pEASY克隆载体后送至生工公司进行测序。测序无误的单克隆加甘油后保存于-80℃备用。

1.3 OBP51序列分析

使用NCBI的ORF Finder进行ORF预测，使用SignalP 5.0分析信号肽，使用COBALT进行多序列比对，使用Compute pI/Mw计算等电点与分子量，使用ExPASy ProtParm进行蛋白质理化特性分析，使用PSIPRED预测蛋白质二级结构[15]；采用Mega 7.0的NJ法构建系统进化树，其中，boot strap为1 000次。

1.4 OBP51组织表达分析

取化蛹后3 d的莲草直胸跳甲成虫触角、头、胸、腹、后足、翅，分别提取总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser去基因组并反转后保存于-20℃备用。使用ABI7500进行定量PCR，体系（20 μL）为：2×TBGreenTMPremixExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）10 μL，引物 OBP51-qF/qR（表 1）各1 μL，模板1μL。反应条件为95℃3min；95℃30s，58℃30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min。60～95℃进行融解曲线分析。采用双ΔCt法计算OBP51的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 OBP51基因克隆及分析

经PCR扩增，电泳检测，得到约400 bp的特异条带，随后克隆和测序，获得OBP51的cDNA全长为 489 bp（图 1），其中，5′UTR 34 bp，ORF 411 bp，3′UTR 44 bp，编码 136 个氨基酸；经 Blast比对，其与多种其他昆虫OBP均具有高的相似性，其中，与大红葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a最高，为40.52%。初步确定该基因为气味结合蛋白，并命名为AhygOBP51。

2.2 OBP51序列分析

信号肽分析表明，AhygOBP51含有18个氨基酸残基的信号肽，成熟蛋白为118个氨基酸，分子量为13.06ku，等电点为4.83，为酸性蛋白。含有4个保守的半胱氨酸残基，缺少Classic OBP特征模式C1X24-29C2X3C3X22-43C4X8-10C5X8C6中的C2和 C5，为 Minus-C 型 OBP。赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、苏氨酸（Thr）含量均高于 10%，分别为11.9%，11.9%，11.0%和10.2%。不含精氨酸、色氨酸和酪氨酸。总平均疏水性-0.477，不稳定系数40.52，脂肪族氨基酸指数74.41，表明AhygOBP51为脂溶性疏水蛋白，与气味结合蛋白在触角淋巴液的疏水环境是相符的。二级结构预测显示，主要为α- 螺旋（helix），占 68.6%；其次为无规则卷曲，占28.8%。其符合气味结合蛋白的结构特点。

2.3 OBP51多序列比对和进化分析

将AhygOBP51与其他物种OBPs进行多序列比对，结果发现（图2），除了含有4个保守的半胱氨酸残基外，在C1与C3之间含有保守的苯丙氨酸（F），C4之后有更加保守的组氨酸（H），推测这些保守的氨基酸残基可能与其定位或者运输气味分子的功能密切相关。

系统进化分析显示（图3），虽同为Minus-C型OBP，但被分为4个大分支，AhygOBP51与大红葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a的进化距离最近，与食粪金龟（Onthophagus taurus）OBP56d、大蜡螟（Galleria mellonella）OBP56d、葡萄花翅小卷蛾（Lobesia botrana）OBP44等位于同一大分支上。

2.4 OBP51表达分析

采用定量PCR对OBP51在成虫不同组织的表达模式进行分析，结果显示（图4），在触角中高表达，在后足中也高表达，且雄虫后足的表达量高于雌虫后足。OBP51在不同组织中的表达量大小为触角≈后足＞头＞翅＞胸＞腹。在触角和后足中的高表达提示，其除了参与触角对气味分子的识别外，可能还参与后足的其他功能。

3 结论与讨论

莲草直胸跳甲作为入侵性杂草喜旱莲子草的专食性天敌，在该恶性杂草的生物防治过程中占有重要的地位。本研究克隆得到莲草直胸跳甲的AhygOBP51，具有4个保守的半胱氨酸残基，模式符合Minus-COBPs家族的典型特征。Blast分析显示，编码蛋白与大红葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a相似性最高，为40.52%；系统进化分析也表明，AhygOBP51与大红葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a等聚为一支，表明其亲缘关系较近，可能具有相似的功能。

OBP基因最早被发现特异性表达于家蚕触角中[16]。后来更多的研究发现，OBPs主要在化学感受器官中表达[17]，在翅、足中也表达。除了触角，其他组织中也分布有大量的味觉、嗅觉感器，推测可能参与昆虫对寄主的定位[18-20]。组织表达分析显示，AhygOBP51在后足、触角中高表达，这可能与昆虫能高效感受环境中各种气味有关。除了触角，OBP在足中高表达也在其他昆虫中被发现，如茶尺蠖中多个OBP在足中高表达[21]；同样的结果也在大草蛉[22]、松褐天牛[23]、茄无网蚜[24]中被发现，推测可能与感知寄主植物非挥发性物质有关[25-28]，此推测有待进一步证实。

本试验成功克隆了莲草直胸跳甲OBP51基因，并进行了相关生物信息学分析；荧光定量PCR分析显示，该基因在触角、足中高表达，揭示其在莲草直胸跳甲的化学感知过程中具有重要功能。后续拟开展包括RNA干扰、荧光竞争结合试验等工作深入研究其功能。