一例鸡传染性法氏囊病病毒的分子鉴定

吉 涛，曹 晶，陆冰洋

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是通过感染鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）而引起发病[1]，鸡传染性法氏囊病病毒在病毒学分类中属于双股双阶段RNA病毒[2]，可以对雏鸡的免疫器官即法氏囊造成破坏，从而引起免疫抑制。鸡传染性法氏囊病造成禽类发病具有急性发病、高度接触性感染等特征[3]。IBDV由A和B共2个RNA片段组成（A片段碱基长度大约为3.4 kb，其含有2个部分重叠的开放阅读框（ORF）。其中，大的开放阅读框（ORF）编码vp2-vp4-vp3聚合蛋白，其分子质量为110 ku，然后断裂成vp2、vp4、vp3 3种蛋白。vp2分子质量为48 ku；vp4分子质量为29 ku；vp3分子质量为33 ku[4-5]；小开放阅读框（ORF）编码病毒的非结构蛋白vp5。B片段碱基长度大约2.85 kb，编码vp1，vp1分子质量为91 ku[6-9]）。vp3基因是鸡传染性法氏囊病病毒的一个主要结构蛋白，是病毒衣壳的主要构成成分，含有鸡传染性法氏囊病病毒的特异性抗原决定簇，该抗原决定簇具有线性依赖性的特性，也具有中和抗原表位，但数量不多，具有相当的免疫保护力[10]。

近年来，随着鸡传染性法氏囊病超强毒（Very virulent infectious bursaldisease virus，vvIBDV） 的出现，能够使疫苗免疫失败[11-13]，目前有效的防治手段有卵黄抗体[14]等，鸡传染性法氏囊病已经成为能够广泛对世界性包括我国在内的养禽业造成经济损失的重要病原之一[15-18]。所以，对鸡传染性法氏囊病的防控与诊治提出了更高的要求，对鸡传染性法氏囊病进行早期准确的诊断具有相当重要的意义和价值。

本研究利用PRC技术针对疑似IBD进行分子鉴定，并对IBDVvp3基因进行测序比对，分析研究地区IBDV的流行趋势，旨在为IBD防治提供理论依据，为进一步建立高特异性鉴别诊断分子生物学方法提供条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 某规模化鸡场雏鸡群发病，病初精神沉郁，排白色水样稀粪，脱水、虚弱、死亡。剖检可见，法氏囊呈黄色胶胨样水肿、黏膜上覆盖纤维素性渗出物；肾肿胀，充满白色尿酸盐，脾脏及腺胃和肌胃交界处黏膜出血。无菌采集病料，1 mL PBS加肝脏研磨1 min，6 000 r/min离心，取上清，低温保存。

1.1.2 主要试剂 鼠源反转录酶（M-MLV）和RNase inhibitor，DNA marker 和 PCR kit均购自TAKARA公司；Trizol购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank登录的IBDVvp3基因，参考鸡传染性法氏囊病病毒序列，经Primer5对vp3基因序列设计并合成了一对引物：F：5′-CGTTTCCCTCWCAATCCACG-3′；R：5′-CT CAAGGTCCTCATCAGAGAG-3′。

1.2.2 病毒RNA的提取及vp3的扩增 参照RNA常规提取方法，取1.1.1病毒上清液250 μL，加入Trizol 750 μL，剧烈振荡 15 s混匀，静置 5 min。加入150 μL氯仿振荡30 s混匀，4℃离心机12 000 r/min离心5 min。取上清液加入500 μL的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃离心机12 000 r/min离心20 min，弃去上清；抽取-20℃预冷75%DEPC乙醇1 mL加入沉淀中洗涤，4℃离心机12 000 r/min离心5 min，弃去液体；虹吸，干燥沉淀，加20 μL DEPC水，水浴锅中50℃水浴10 min，开始反转录。反转录体系为：1 μL random primer，10 μL RNA 模板和 4 μL dNTP，混匀后65℃水浴10 min，迅速取出放入冰浴 5 min，加入 1 μL M-MLV，4 μL 反应 Buffer和1 μLRNase inhibitor，37 ℃水浴 2 h。以反转录产物为模板，加入vp3特异引物进行PCR反应。PCR体系：dNTP 4 μL，PCR 反应 Buffer 5 μL，cDNA 模板5 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL ，DNA 聚合酶1 μL，Mg2+5 μL，ddH2O 26 μL，PCR 反应为 50 μL体系。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min；55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物送华大公司进行测序。

1.2.3vp3序列分析 根据vp3片段测序结果，利用DNAstar软件对其核苷酸高变区序列及vp3碱基序列推导的氨基酸序列与GenBank中登录的其他IBDV参考毒vp3片段进行比较分析。参考名称（登录号）为：IBD疫苗毒株CEF94（AF194428.1）；IBD中等毒力致弱毒株IZO-2512（JQ315171.1），B87（DQ906921.1）；IBD标准经典强毒株Ⅱ型毒株OH（U30818.1），ORF's（Z21971.1），52/70（D00869.2）；IBD超强毒株韩国KSH（JQ315171.1），香港HK46（AF092943.1），日本 OKYM（D49706.1）；变异株 Variant E（AF133904.1）；经典弱毒株 D78（AF499929.1），Cu-1（X16107.1）。

2 结果与分析

2.1 vp3扩增结果

提取鸡传染性法氏囊病肝脏研磨上清液中病毒RNA，经反转录取得cDNA后，以鸡传染性法氏囊病病毒vp3特异引物进行PCR反应扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测可知，目的片段约831 bp（图1），与预期大小相符。

2.2 IBDVvp3同源性分析

测序结果表明，IBDVvp3基因核苷酸长度为831 bp。使用DNAstar分析软件将鸡传染性法氏囊病病毒vp3基因与国内外已报道的vp3基因核苷酸序列进行同源性比对，结果表明，鸡传染性法氏囊病病毒vp3核苷酸序列与香港超强毒株HK46（AF092943.1）和日本超强毒株 OKYM（D49706.1）的同源性最高，为98.9%与97.5%；与疫苗株CEF94（AF194428.1），Cu-1（X16107.1），经典弱毒株 D78（AF499929.1）和 IZO-2512（JQ315171.1）同源性相近，分别为94.8%，94.8%，94.7%和94.7%；与中等毒力致弱株B87（DQ906921.1）和经典强毒株52/70（D00869.2）同源性为94.4%和94.3%；与变异株Variant E（AF133904.1）同源性为 93.8%；与Ⅱ型毒株 OH（U30818.1）和 ORF's（Z21971.1）同源性最低，为 84.8%（图 2）。

同时对IBDVvp3氨基酸序列进行同源性分析，结果表明，IBDVvp3氨基酸序列与日本超强毒株 OKYM（D49706.1） 和香港超强毒株 HK46（AF092943.1）的同源性较高，为96.9%和96.2%；与疫苗株 CEF94（AF194428.1）、弱毒株 Cu-1（X16107.1）、经典弱毒株D78（AF499929.1）、中等毒力致弱株I ZO-2512（JQ315171.1）、中等毒力致弱株 B87（DQ906921.1）、标准经典强毒株 52/70（D00869.2）、变异株Variant E（AF133904.1）同源性分别为94.7% ，94.7% ，94.7% ，94.3% ，93.9% ，93.1% 和91.2%；与Ⅱ型毒株 ORF's（Z21971.1）和 OH（U30818.1）同源性较低，为90.5%和88.9%。表明IBDVvp3在氨基酸水平上与超强毒株日本OKYM（D49706.1）和超强毒株香港 HK46（AF092943.1）关系密切（图3）。

2.3 IBDVvp3遗传进化分析

根据鸡传染性法氏囊病病毒vp3核苷酸序列与鸡传染性法氏囊病病毒参考毒株相应序列，使用DNAstar MegAlign构建基因进化树进行分析，结果表明，所选取的鸡传染性法氏囊病病毒参考毒株和检测阳性毒株分成两大分支：血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，其中，血清Ⅰ型由4个部分构成，血清Ⅱ型由2个部分构成；IBDVvp3与香港超强毒株和日本超强毒株亲缘关系最近，与变异毒株Variant E和经典强毒株52/70亲缘关系次之，与鸡传染性法氏囊病病毒中等毒力毒株和弱毒毒株亲缘关系最远，但是和鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株韩国KSH的亲缘关系与中等毒力毒株和弱毒毒株亲缘关系相仿（图 4）。

3 结论与讨论

本研究通过设计引物对IBDVvp3基因进行PCR扩增鉴定，扩增结果为831 bp，编码277个氨基酸，与预期目标相符。将IBDVvp3基因序列测定结果与GenBank经典参考毒株进行核苷酸和氨基酸比对分析，结果表明，IBDVvp3基因在核苷酸水平和氨基酸水平2个方面均与日本超强毒株和香港超强毒株同源性最高，分别为98.9%，97.5%和96.9%，96.2%，表明该病毒在分子水平上属于IBDV。

我国对于鸡传染性法氏囊病一直采用疫苗注射预防为主的防治技术，由于鸡传染性法氏囊病超强毒株和强毒变异株的出现，鸡传染性法氏囊病病毒能够突破和损坏禽类免疫系统，导致鸡传染性法氏囊病的免疫失败屡次发生，给鸡传染性法氏囊病的防治及控制其他传染病继发感染带来巨大的困难。本研究通过对山西地区鸡传染性法氏囊病病毒vp3基因进行分子鉴定，以期为传染性法氏囊病的免疫防治方法提供相应参考。