耳蜗移植神经干细胞的培养和鉴定*

吴佳源 刘俊

神经干细胞的体外培养、诱导定向分化及其在临床上的应用已成为21世纪的一个研究热点。感音神经性聋是耳鼻咽喉科常见病之一，该病严重影响患者的听觉功能及生活质量。目前帮助中重度听力损失患者提高听力的唯一方法是使用人工耳蜗或助听器去直接刺激听神经，但这都受限于复杂的听力损伤机制和组织损伤程度[1]。耳蜗毛细胞的变性、坏死是导致永久性感音神经性聋的主要原因[2]，在哺乳动物中，毛细胞一旦死亡便不会再生[3]。如果能让耳蜗毛细胞再生变成可能，那么这将会给耳聋的治疗带来重大突破。内耳毛细胞的再生由其前体细胞分裂、分化而来，毛细胞的前体细胞有以下几种来源[4]: ①耳蜗感觉上皮内的支持细胞：支持细胞分裂、增殖、分化为毛细胞；或者直接形态转化为毛细胞；②受损区周围的毛细胞，如亚急性损伤毛细胞的自我修复；③基底乳头周围的非感觉性上皮细胞分化；④听觉上皮耳蜗多能干细胞的分化；⑤神经干细胞的分化。可见，通过神经干细胞移植有可能再生耳蜗内的毛细胞，为感音神经性聋患者带来康复希望。因此，本研究以SD孕鼠的胎鼠海马组织为原材料来分离培养神经干细胞，拟为后续干细胞移植实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 孕14～15 d的SD大鼠3只，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2神经干细胞培养主要试剂 标准胎牛血清、青-链霉素溶液(浓度为100 IU/ml)购于上海生工生物工程有限公司;EGF(20 μg)、bFGF(10 μg)购于Peprotech公司;B27添加剂(50×)购于Thermo Fisher公司；DEME/F12(1∶1)、TrypLTM Express(1×)购于Gibco公司;

1.1.3神经干细胞鉴定的主要试剂 鼠抗NSE(1∶100)多克隆抗体，鼠抗GFAP多克隆抗体(1∶100)，Brdu、鼠抗Brdu单克隆抗体(1∶100)，兔抗Nestin多克隆抗体(1∶100)，Cy3标记的羊抗鼠二抗(1∶100)，FITC标记的羊抗兔二抗(1∶100)均购自武汉博士德公司。

1.1.4主要仪器 CO2培养箱(Thermo Fisher)，倒置显微镜(奥林巴斯)，荧光显微镜(日本蔡司)，血细胞计数板(上海求精)。

1.2神经干细胞培养方法

1.2.1神经干细胞无血清培养液的配制 取DMEM/F12(1∶1)100 ml，加入EGF(20 ng/ml)、bFGF(20 ng/ml)、B27添加剂(2%)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青-链霉素溶液1 ml(浓度为100 IU/ml)。配好后4 ℃保存。培养基应保持新鲜，一般一次配制100 ml并在1周内用完。

1.2.2血清培养基的配制 DMEM/F12(1∶1):90%、胎牛血清：10%。4 ℃保存。

1.2.3神经干细胞提取 取孕14～15 d SD大鼠，用戊巴比妥进行腹腔麻醉，放置于 75% 医用酒精中完全浸泡消毒 5 min，转移至无菌间; 剪开孕鼠腹腔，暴露并取出子宫，放入培养皿，转入超净工作台;除去子宫和胎膜，仔细分离出胎鼠海马，用常温PBS漂2次，尽量将脑膜剥除干净。用眼科剪将脑组织剪成细小碎块，然后将其移到10 ml离心管中(一个脑组织配一支试管)。离心(1 000 r/min，2 min)后丢弃上清液，在试管中加入2倍脑组织体积的TrypLTM Express(1×)，在37 ℃水浴下轻柔振荡5 min，加入DEME/F12(1∶1)至试管刻度5 ml，用吸管轻柔吹打，经200×细胞筛过滤，离心(1 000 r/min，5 min)丢弃上清液。再用无血清培养基重悬细胞，轻柔吹打数次以形成单细胞悬液。以密度1×106ml-1(台盼兰计数细胞密度，不计死亡细胞)接种于25 cm2的透气培养瓶中然后置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2恒温培养箱内培养。

1.2.4神经干细胞培养 在倒置显微镜下观察并记录培养细胞的状况，如培养液的颜色、杂质情况，培养细胞的密度、折光度以及神经球形成大小、折光度等。然后根据情况隔1～2 d离心(1 000 r/min，5 min)后半量换液，再视神经球生长大小情况进行传代，一般4天左右传代，传代时全部换液。为了解神经干细胞的增殖状态，待培养3～4代后对每代的神经球个数及直径进行测量。采用美国图像处理软件(image processing plus system 6.0)检测神经球个数，每样本随机选择12个神经球测量平均直径。

1.3神经干细胞鉴定方法

1.3.1NSCs的Nestin免疫组化荧光鉴定 将传至第3代且培养成神经球的神经干细胞置入装有0.1%多聚赖氨酸处理过的盖玻片的24孔板中,然后置于培养箱继续培养，过夜后收获贴壁细胞，用FITC标记免疫荧光法检测巢蛋白(nestin)的表达。方法如下：用1×PBS洗3次(5 min/次)；4%的多聚甲醛固定20 min；丢弃固定液，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；用0.25%TritonX-100破膜10分钟；丢弃破膜液，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；用5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原(封闭液盖过盖破片即可),室温孵育30分钟，丢弃封闭液，尽量吸干残液,不用PBS洗；滴加1∶100稀释度的兔抗nestin多克隆抗体(一抗),4 ℃湿盒孵育过夜；丢弃一抗，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；滴加FITC标记的羊抗兔二抗(1∶100)，室温孵育1小时；丢弃二抗，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；挑起盖玻片后，贴有细胞的一面向下盖上已加入抗荧光猝灭剂的载玻片(注意不要产生气泡)；在荧光显微镜下观察、照相并记录。

1.3.2Brdu掺入试验 培养的第3代神经干细胞悬液行Brdu标记。在机械分离传代时，按6 μg/ml(20 μmol/L)的浓度在NSCs悬液加入Brdu。按1.3.1的方法进行处理并收获细胞，用Nesein与Brdu免疫荧光双标技术鉴定，方法如下：用1×PBS洗3次(5 min/次)；用90%乙醇/1%冰乙酸固定10分钟；用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残夜；用0.25%TritonX-100破膜10分钟；丢弃破膜液，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；0.4%胃酶消化室温20分钟；2N盐酸室温处理30分钟；丢弃盐酸，吸干残液，硼砂(0.1 mol/L)室温中和10分钟；丢弃硼砂，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原,室温孵育30分钟；丢弃封闭液，吸干残液，不用PBS洗，加入鼠抗BrdU和兔抗Nestin一抗混合液,4 ℃湿盒反应36 h；丢弃一抗混合液，用1XPBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；滴加FITC标记的羊抗兔和Cy3标记的羊抗鼠的二抗混合液,室温孵育3 h。丢弃二抗混合液，用1×PBS洗3次(5 min/次),尽量吸干残液；挑起盖玻片后，贴有细胞的一面向下盖上已加入抗荧光猝灭剂的载玻片(注意不要产生气泡)；在免疫荧光显微镜下观察、照相并记录。

1.3.3荧光染料Hoechest33342标记神经干细胞 培养的第3代NSCs悬液离心800 r/5 min,离去上清液，细胞沉淀重新加入无血清培养基，机械吹打均匀后加入用1×PBS溶解Hoechst33342,终浓度为10 μg/ml,37 ℃，反应2 h,将标记细胞离心沉淀并用新鲜培养液清洗2次，每次离心5 min,并反复吹打使其变成单细胞，在荧光显微镜下查看细胞核标记情况。

1.3.4诱导分化NSCs及其鉴定 将经荧光染料标记后的NSCs按1.3.1的方法进行培养并收获细胞，用FITC标记免疫荧光法检测巢蛋白(Nestin)的表达，同时观察其细胞核中荧光染料标记后的蓝色荧光的表达。NSCs 的诱导分化：将培养的、经荧光燃料标记的第2代NSCs反复吹打，制成单细胞悬液，置入装有0.1%多聚赖氨酸处理过盖玻片的24孔板中,培养条件为: 血清培养基，37 ℃,5%CO2,每 2～3 d换液一次，每天在显微镜下观察细胞状态，4～5 d后可收获分化细胞。用Cy3标记免疫荧光法检测分化后细胞的神经元特异性烯醇化酶(NSE)，星状胶质细胞特异性表达的胞浆蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，少突胶质细胞的特异性抗原2，3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)，同时观察其细胞核中荧光染料标记后的蓝色荧光的表达。Cy3 标记免疫荧光法方法同1.3.1(步骤分别滴加1∶100稀释度鼠抗GFAP多克隆抗体、鼠抗CNP多克隆抗体及鼠抗NSE多克隆抗体,4 ℃孵育过夜)。

2 结果

2.1大鼠神经干细胞的培养结果 由孕14～15 d的胎鼠海马组织分离、培养的细胞, 初代培养时细胞以椭圆形为主，表面可见绒毛，细胞折光性强，呈悬浮生长。经传代培养后，细胞呈球形增长,生长速度快、活性好(图1)。在培养过程中，随着细胞球体积的不断增大，部分细胞球可融合，有的细胞球中央部分由于缺少营养，而出现“老化”，透光性变差(图2)。本实验培养的细胞经传8代以上仍可继续增殖生长，活性好。第4～9代神经干细胞球的数量和直径见表1。

表1 第4～9代神经干细胞球的数量(个)和直径

2.2大鼠神经干细胞的鉴定结果

经行Brdu 与 Nestin 的免疫荧光双标染色，可见神经干细胞球Brdu 与 Nestin 均为阳性(图3a、b)。

用Hoechst33342荧光染料标记神经干细胞后用FITC标记免疫荧光法检测巢蛋白(Nestin)的表达，同时观察其细胞核中荧光染料标记后的蓝色荧光的表达(4a、b)。

荧光染料标记后的神经干细胞经含10%的胎牛血清(不含生长因子)的血清培养基培养诱导分化后,细胞团2～4 h开始贴壁,贴壁的细胞分化,并由NSCs团发出呈放射状生长的细胞(图5、6)。

用Cy3标记免疫荧光法检测分化后细胞的神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞的特异性抗原(CNP)的表达，同时观察其细胞核中荧光染料标记后的蓝色荧光的表达(图7～9)。

3 讨论

神经干细胞可以从发育中的大脑区域中分离获得，包括大脑皮层、海马、纹状体、嗅球、螺旋神经节神经元和嗅觉上皮[5，6]，其具有自我更新能力和多能性。移植的神经干细胞被证明可以迁移到脑损伤部位并分化成原生的细胞类型，如少突胶质细胞[7]、小胶质细胞、星形胶质细胞、皮质神经元[8]和脊髓神经胶质和神经元[9]，表明神经干细胞既能替换损坏的神经组织，又能恢复损伤后的功能。

被植入的神经干细胞在形态学和蛋白质表达上的不同取决于它们在耳蜗内所处的位置，这表明耳蜗内的微环境对神经干细胞的发展起到重要的作用。可以假设，一旦这个神经干细胞系迁移到耳蜗内，接受到来自微环境的信号后，这些细胞便表达由内耳细胞表达的细胞基因命运程序，并对该程序进行正反馈和负反馈调节以达到平衡。这同时也说明成年的哺乳动物耳蜗内还保留着一些信号，这些信号对于干细胞沿着耳蜗的表型分化是很有必要的，尽管这些信号并不能作用于内耳的细胞群使它们再生为毛细胞[10]。可见，通过神经干细胞移植有可能再生耳蜗毛细胞，从而为感音神经性聋患者的康复带来希望。

图1 SD大鼠NSCs球(×200) 图2 “老化”的NSCs球(×200) 图3 a.NSCs球Nestin阳性,FITC标记成绿色荧光(荧光显微镜×200);b.同一视野下细胞核Brdu阳性,Cy3标记成红色荧光(荧光显微镜×200) 图4 a.荧光染料标记后NSCs呈Nestin阳性,FITC标记成绿色荧光(荧光显微镜×200);b.同一视野下细胞核Hoechst荧光染料呈蓝色荧光(荧光显微镜×200) 图5 贴壁的神经细胞球 图6 贴壁分化的神经干细胞 图7 a.Cy3标记星形胶质细胞特异性蛋白GFAP(红色荧光);b.同一视野下细胞核Hoechst荧光染料呈蓝色荧光 图8 a.Cy3标记神经元特异性蛋白NSE(红色荧光);b.同一视野下细胞核Hoechst荧光染料呈蓝色荧光 图9 a.Cy3少突胶质细胞特异性抗原CNP(红色荧光);b.同一视野下细胞核Hoechst荧光染料呈蓝色荧光

研究显示，培养基中添加 bFGF 和 EGF 2种神经干细胞培养常用的丝裂原，二者联合使用能够在短时期内培养出大量神经干细胞[11]；添加B27( 不含维生素 A) ，可避免神经干细胞在增殖过程中出现分化现象和维持细胞的悬浮状态[12]。本实验从孕14～15 d SD大鼠的胎鼠脑海马组织分离培养得来的细胞,采用无血清培养技术进行悬浮培养,结果细胞具有很强的分裂、增殖及自我更新能力。

细胞培养过程中，细胞传代时能否将神经球吹打成单细胞悬液至关重要，神经球中的神经干细胞通过细胞骨架蛋白、特异的钙连蛋白等形成黏附连接，单纯依靠机械吹打很难将神经球打散，若不能打散，则会极大影响下一代细胞的数量。目前，细胞传代时主要使用的是胰酶消化法，但是胰酶的消化作用容易造成神经干细胞的化学性损伤，而使用血清或酶抑制剂对抗胰酶的消化作用，也可能会降低神经干细胞的活力和增殖率，从而影响实验结果。故本实验使用热稳定性更强、细胞毒性更低、作用更温和的TrypLTM Express，其和胰酶有相同的作用位点，是一种高纯度的重组酶，不需要用血清或酶抑制剂对抗其消化作用。本实验中，先将细胞用TrypLTM Express在37 ℃下作用5 min，然后用3 ml的吸管轻柔吹打，可以比较容易地获得单细胞悬液。吹打过程中动作要轻柔，勿用力过猛，否则容易损伤细胞。传代的时机对能否获取高质量的单细胞悬液也很重要，如果传代时神经球体积过大，则细胞间的细胞连接非常紧密，神经球很难被吹散，若强行分离，则会导致神经干细胞破坏、溶解、死亡以及贴壁分化；如果传代时神经球体积过小，虽然比较容易将神经球吹散，但获得的神经干细胞的数量偏少。本实验一般在培养4～5天后传代，但具体要视细胞球的生长速度。

Nestin是哺乳动物中枢神经系统干细胞的主要骨架蛋白，也称为巢蛋白，是神经干细胞的主要鉴定指标之一。由于Nestin还存在于其它细胞，如某些肿瘤细胞及胰腺祖细胞等，故对于神经干细胞的鉴定还要看它是否可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞及能否分裂增殖，只有满足上述条件的细胞才算是神经干细胞[13]。神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标志物分别为特异性烯醇化酶(NSE)、胞浆蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2，3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)。神经干细胞在胎牛血清作用下，可分化为NSE表达阳性的神经元样细胞、GFAP表达阳性的星形胶质细胞及CNP表达阳性的少突胶质细胞，说明培养出的NSCs具有多向分化能力。BrdU作为胸腺嘧啶的衍生物，常用来标记活细胞中合成的DNA，可稳定复制到子代细胞中，从而可用于检测细胞的增殖能力。本实验中经传培养代3次的神经干细胞，Nestin和BrdU均表达阳性。Hoechst是双间二氮茚类物资，为特异性的DNA染料，对细胞无毒，可以对细胞核着色，在倒置荧光显微镜下发出蓝色荧光，染色快(1～3 h)，标记率可达 100%[14]。

本实验对胎鼠海马组织来源的神经干细胞进行了培养及鉴定，结果显示所培养的细胞 Nestin 呈阳性反应，分化后细胞特异性标志物NSE、GFAP、CNP表达阳性，并且培养的细胞能够分裂增殖，证明培养的细胞是神经干细胞，为以后的神经干细胞耳蜗移植试验奠定了基础。本文如果能对NSE+GFAP+CNP进行多重免疫荧光标记鉴定，则能更进一步验证神经干细胞的多向分化潜能，此为今后的研究方向。