两种药物对褶皱臂尾轮虫和两种纤毛虫的急性毒性研究

汤荣成，齐红莉,2，王红宇，郑晓楠，李雪菡，王 茜

( 1.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.中国海洋大学，海洋生物多样性与进化研究所，原生动物学实验室，山东 青岛 266003 )

近年来，在水产经济动植物的养殖中(鱼类、甲壳类、藻类和海参等)，由纤毛虫所导致的病害的发生范围及危害程度均呈递增趋势[1-2]。褶皱臂尾轮虫(Brachionusplicatilis)广泛分布于半咸水和海水水域中，具有易培养、繁殖快、营养丰富等优点，是理想的生物饵料[3-4]。在其培养过程中也经常会出现纤毛虫病害，经人工鉴定有海洋尾丝虫(Uronemamarinum)和黄色伪角毛虫(Pseudokeronopsisflava)[5-6]。海洋尾丝虫属盾纤目、尾丝虫属[5]，黄色伪角毛虫属腹毛亚纲、伪角毛虫属[6]。有关海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的研究报道较多集中于形态分类学观察及细胞发生[7-8]，关于其生态学方面的研究较少。药物对纤毛虫的毒性研究，国内外均有报道，但多集中于腹毛类[9]、游仆类[10]、车轮虫[11]等。硫酸锌和三氯异氰尿酸作为常见的渔药，其对水生生物毒性的研究报道较多集中于藻类、浮游动物、鱼类等方面[12-14]，目前关于硫酸锌和三氯异氰尿酸对海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫急性毒性的研究尚未见报道。

笔者以褶皱臂尾轮虫大规模培养过程中出现的海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫为研究对象，研究硫酸锌与三氯异氰尿酸对褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的急性毒性，以期为褶皱臂尾轮虫的培养过程中海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的暴发提供相应的治理方法，同时也填补海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的毒理学研究空白。

1 材料与方法

1.1 材料来源及种群培养活化

褶皱臂尾轮虫取自天津极地海昌海洋馆的饵料培养室，在实验室内经镜检分离后进行单克隆纯种培养，盐度30、pH 8.0±0.2、溶解氧5 mg/L，培养在温度25 ℃、光照度2000 lx、光照周期14L∶10D的光照培养箱中进行。

海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫均取自天津市极地海洋馆褶皱臂尾轮虫培养池，经活体观察和蛋白银染色鉴定到种，显微分离纯种并单克隆培养，培养条件同褶皱臂尾轮虫培养条件。

人工海水的配制：氯化钠30.00 g、硫酸镁3.00 g、氯化钙0.72 g、氯化钾0.259 g、碳酸氢钠0.084 g、硼酸0.144 g、生石灰0.120 g、蒸馏水1000 g，经0.22 μm的滤膜抽滤和高温灭活后使用。

1.2 方法

采用水生生物毒性试验方法[15]，先进行预试验。根据预试验结果，设置正式试验的6个质量浓度组(包括空白对照组和5个质量浓度梯度组)。具体质量浓度为：硫酸锌对褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫、黄色伪角毛虫的药物质量浓度分别为0.00、2.00、2.60、3.40、4.40、6.00 mg/L，0.00、1.80、2.40、3.20、4.40、5.60 mg/L和100.00、200.00、400.00、800.00、1000.00 mg/L；三氯异氰尿酸对褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的药物质量浓度分别为0.00、0.30、0.60、0.80、0.90、1.00 mg/L，0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L和0.00、0.40、0.60、1.00、1.20、1.60 mg/L。每个质量浓度设3个平行。试验于六孔细胞培养板中进行，每孔中加入3 mL盐度30的人工海水，褶皱臂尾轮虫和黄色伪角毛虫接种密度为10个/mL、海洋尾丝虫接种密度为200个/mL，试验开始连续观察6 h，随后每隔12 h观察计数1次。

1.3 数据分析与处理

急性毒性试验半致死质量浓度采用概率单位法[15]，通过作图分析获得。用SPSS 20.0和Excel 2016作图和分析。

2 结果与分析

2.1 试验观察

经硫酸锌处理后，褶皱臂尾轮虫运动速度受到一定的影响，硫酸锌质量浓度2.60 mg/L以下的试验组24 h时只有少部分褶皱臂尾轮虫运动速度下降，但并未引起死亡；3.40 mg/L以上试验组褶皱臂尾轮虫运动速度受到明显的影响，6.00 mg/L试验组现象最为明显，12 h时大部分褶皱臂尾轮虫贴附于六孔板底部，运动缓慢，24 h死亡率为77.8%，72 h时全部死亡(图1a)。

海洋尾丝虫暴露于不同质量浓度的硫酸锌溶液，12 h时海洋尾丝虫大量死亡，12 h时1.80、2.40、3.20、4.40、5.60 mg/L试验组的死亡率分别为39.0%、46.5%、53.2%、55.6%、66.0%；24 h时1.80、2.40、3.20、4.40、5.60 mg/L试验组的死亡率为46.0%、58.0%、60.0%、67.0%、70.0%；48 h时所有试验组海洋尾丝虫数量均出现增长的现象(图1b)。

黄色伪角毛虫对硫酸锌很不敏感，12 h时质量浓度100.00 mg/L以下的试验组对黄色伪角毛虫影响较小，200.00 mg/L以上的试验组虫体才出现中毒现象，虫体变短变粗，游动能力下降；24 h时100.00、200.00、400.00、800.00、1000.00 mg/L试验组的死亡率分别为33.0%、47.0%、60.0%、75.0%、90.0%；36 h 1000.00 mg/L试验组全部死亡(图1c)。

褶皱臂尾轮虫经三氯异氰尿酸处理后，质量浓度组0.30 mg/L以下的试验组中轮虫运动速度受到一定影响；质量浓度0.60 mg/L以上的试验组中轮虫运动速度明显下降；24 h时0.30、0.60、0.80、0.90、1.00 mg/L试验组的死亡率分别为37.0%、60.0%、83.0%、87.0%、90.0%；1.00 mg/L试验组36 h全部死亡(图2a)。

三氯异氰尿酸作用于海洋尾丝虫后，所有试验组的海洋尾丝虫异常活跃，游泳速度明显变快，同时虫体会发生破裂，12 h时0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L试验组海洋尾丝虫死亡率分别为38.1%、38.6%、52.3%、68.2%、75.6%；24 h时0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L试验组海洋尾丝虫死亡率分别为40.0%、48.0%、61.0%、80.0%、82.0%；0.50 mg/L试验组48 h全部死亡(图2b)。

在前12 h，三氯异氰尿酸质量浓度小于0.60 mg/L的试验组中黄色伪角毛虫虫体无明显的变化，质量浓度大于1.20 mg/L的试验组中黄色伪角毛虫虫体会收缩变小，运动速度变慢；24 h时0.40、0.60、1.00 mg/L试验组数量开始增多，最大质量浓度1.60 mg/L试验组，24 h时黄色伪角毛虫死亡率为70%，60 h时黄色伪角毛虫数量开始增多(图2c)。

2.2 急性毒性试验

采用概率单位分析法，24 h硫酸锌对褶皱臂尾轮虫的死亡率概率单位(y)与所加药物质量浓度对数(x)的线性回归方程：y=4.9155x+1.7895，r2=0.9727；24 h半致死质量浓度为4.499 mg/L。

硫酸锌对海洋尾丝虫的急性毒性线性回归方程：12 h，y=1.3134x+4.3934，r2=0.9725；24 h，y=1.2273x+4.6452，r2=0.9365；12 h和24 h半致死质量浓度分别为2.896 mg/L和1.946 mg/L。

硫酸锌对黄色伪角毛虫急性毒性线性回归方程：12 h，y=2.3089x-0.8295，r2=0.9300；24 h，y=1.5160x+1.4455，r2=0.9093，12 h和24 h半致死质量浓度分别为334.808 mg/L和221.135 mg/L。

褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫对硫酸锌的耐受性顺序为黄色伪角毛虫>褶皱臂尾轮虫>海洋尾丝虫。

24 h三氯异氰尿酸对褶皱臂尾轮虫急性毒性线性回归方程：y=3.1487x-3.2301，r2=0.9519；24 h半致死质量浓度为0.412 mg/L。

三氯异氰尿酸对海洋尾丝虫急性毒性线性回归方程：12 h，y=1.4715x+1.5709，r2=0.8181；24 h，y=1.7859x+1.0323，r2=0.8912；12 h和24 h半致死质量浓度分别为0.519 mg/L和0.167 mg/L。

三氯异氰尿酸对黄色伪角毛虫急性毒性线性回归方程：12 h，y=2.0827x-2.2555，r2=0.9716；24 h，y=4.0597x-7.6114，r2=0.9565；12 h和24 h半致死质量浓度分别为3.044 mg/L和1.255 mg/L。

褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫对三氯异氰尿酸的耐受性顺序为黄色伪角毛虫>褶皱臂尾轮虫>海洋尾丝虫。

图1 硫酸锌对褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的急性毒性作用a.褶皱臂尾轮虫； b.海洋尾丝虫； c.黄色伪角毛虫.

图2 三氯异氰尿酸对褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫的急性毒性作用a.褶皱臂尾轮虫； b.海洋尾丝虫； c.黄色伪角毛虫.

3 讨 论

硫酸锌常被用于驱杀养殖水体中的纤毛虫[16]。本研究表明硫酸锌对褶皱臂尾轮虫、海洋尾丝虫和黄色伪角毛虫24 h半致死质量浓度分别为4.499、1.946 mg/L和221.135 mg/L，有研究得出锌离子对褶皱臂尾轮虫的24 h半致死质量浓度为3.940 mg/L，95%置信区间为3.404～4.549 mg/L[17]，本试验结果与之相一致，说明褶皱臂尾轮虫对锌离子并未产生抗药性。硫酸锌对海洋尾丝虫24 h半致死质量浓度要高于硫酸锌在水产养殖生产中的防治用量(1.00 mg/L)，低于硫酸锌对褶皱臂尾轮虫24 h半致死质量浓度，高于硫酸锌对褶皱臂尾轮虫的安全质量浓度，所以当使用硫酸锌治疗褶皱臂尾轮虫养殖中出现的海洋尾丝虫病害时，需要充分控制用药量，注意重复施药的时间，因为施药后24 h，硫酸锌对海洋尾丝虫能起到有效的杀灭作用，48 h后作用不明显，这与实际养殖过程中使用渔药硫酸锌时需要隔日重复用药一次相一致。本试验研究得出黄色伪角毛虫对硫酸锌的耐药性要强于褶皱臂尾轮虫，推测可能为部分原生动物对药物的耐药性强于高营养级的动物。邱彦涛[18]研究表明，高锰酸钾质量浓度为2.00 mg/L时，寡毛双眉虫(Diophrysoligothrix)可以正常存活；谢钦铭等[19]研究表明，高锰酸钾对褶皱臂尾轮虫的24 h半致死质量浓度为0.873 mg/L。由此可见，高锰酸钾对褶皱臂尾轮虫和寡毛双眉虫的毒性结果与本试验结果相类似。此外生物对药物的耐受性还与pH、温度、生活方式等有关，如Boersma等[20]研究表明，温度升高杂食性浮游生物将从掠食性转向食草性。