野生与养殖黑斑蛙肌肉营养品质的比较分析

何志刚，伍远安,2，徐永福,，王冬武,2，陈建国，李金龙

( 1.湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153； 2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000； 3.南县丰年生态黑斑青蛙养殖有限公司，湖南 益阳 413200 )

黑斑蛙(Rananigromaculata)是中国分布最广的两栖动物之一[1]。黑斑蛙肌肉肉质细嫩，营养丰富，是我国重要经济两栖动物之一。长期以来，由于人类的过度捕食、栖息地生境破碎与改变、稻田农药化肥过度使用及环境污染等影响，野生黑斑蛙种群数量不断下降[2]。为了满足市场需求和挽救野生黑斑蛙自然资源，其人工养殖业已开展，湖南省、湖北省依法开放办理黑斑蛙人工驯养繁殖经营许可证，批准养殖经营[3]。2017年黑斑蛙人工养殖面积约60 hm2，黑斑蛙饲料市场容量达5×104t，但缺乏饲料营养成分基础研究[4-5]。有关黑斑蛙研究报道主要集中于生理、遗传、寄生虫和农药重金属毒性等方面[6-10]，对其肌肉营养成分的研究未见报道。诸多研究报道表明，不同养殖模式下水产品的营养品质有一定差异。人工养殖黑斑蛙投喂膨化饲料，生长环境和饲料营养成分变化对其营养价值的影响是决定黑斑蛙保护开发及人工养殖的关键。笔者对野生与养殖黑斑蛙肌肉的一般营养成分、氨基酸含量、脂肪酸含量、矿物元素含量进行测定分析，对其肌肉品质进行全面评价比较，旨在为黑斑蛙野生资源保护及开发利用提供基础资料，并同时为黑斑蛙人工养殖及其配合饲料的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料采集

试验用野生黑斑蛙成蛙于2017年7月捕获于湖南省益阳大通湖，共30只，体质量52～101 g，体长8.2～12.8 cm；养殖黑斑蛙(投喂膨化配合饲料)取自南县丰年生态黑斑青蛙养殖有限公司，共30只，体质量56～113 g，体长8.5～13.2 cm。配合饲料的营养成分组成：水分9.34%、粗蛋白质41.90%、粗脂肪5.78%、粗灰分9.48%。

1.2 样品处理

野生组与养殖组黑斑蛙各30只，每组设置3个平行。解剖剥取黑斑蛙两后肢肌肉，用多功能绞肉机绞碎、混匀，-20 ℃条件下保存备用。肌肉样品分成4份，分别用于测定一般营养成分、氨基酸组成、脂肪酸组成和矿物元素含量。每个指标重复测定3次。

1.3 测定方法

1.3.1 一般营养成分测定

水分含量的测定参照105 ℃恒温烘干法(GB 5009.3—2016)进行，粗蛋白含量测定参照凯氏定氮法(GB 5009.5—2016)进行，粗脂肪含量测定参照索氏抽提法(GB 5009.6—2016)进行，灰分含量测定参照马福炉550 ℃灼烧法(GB 5009.4—2016)进行。

1.3.2 氨基酸和脂肪酸测定

氨基酸采用盐酸水解法(GB 5009.124—2016)，使用Syknm S7130氨基酸自动分析仪测定。样品称取后放入水解管，加入15 mL 6 mol/L的盐酸，冷冻充入高纯氮气迅速封口置于恒温干燥箱110 ℃水解22 h，溶液冷却过滤定容至50 mL容量瓶，吸取1 mL滤液至15 mL试管，用试管浓缩仪减压干燥挥发盐酸，加水2 mL溶解后再次蒸干。准确加入2 mL pH 2.2的柠檬酸钠溶液溶解，过0.22 μm滤膜上机测试。

脂肪酸组成采用气相色谱/质谱法，使用7890C-5975A气相色谱—质谱联用仪测定。采用改进的Folch法萃取总脂[11]，在总脂中加入1 mL 10%浓硫酸—甲醇溶液，60 ℃水浴甲酯化15 min后冷却。加入正己烷1 mL振荡，静置分层后取上清液上气相色谱—质谱联用仪分析。气相色谱条件如下：

色谱柱：HP-88毛细管柱(100 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升温，初始温度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃保持25 min，再以5 ℃/min升至250 ℃；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，进样量0.2 μL，分流比50∶1；

质谱条件：离子源为EI，温度230 ℃，电离能量70 eV；

MS接口温度280 ℃；美国国家标准技术研究所08标准谱库检索；按照出峰先后顺序定性，采用面积归一法计算各主要脂肪酸的相对百分比含量。

1.3.3 矿物元素测定

矿物元素(除铅元素外)采用微波消解—电感耦合等离子体—质谱法(GB 5009.268—2016)，使用Thermo Fisher Xseries 2电感耦合等离子体质谱仪测定，铅元素采用石墨炉原子吸收光谱法(GB 5009.12—2010)，使用Thermo Fisher iCE3500原子吸收分光光度计测定。

1.4 氨基酸评价方法

黑斑蛙肌肉氨基酸依据联合国粮农组织/世界卫生组织建议的氨基酸评分标准模式和中国预防医学科学院提出的全鸡蛋蛋白质化学评分模式，按下式计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)[12-13]：

式中，Aa为试验样品氨基酸含量，Ab为联合国粮农组织/世界卫生组织评分标准模式中同种氨基酸含量，Ac为全鸡蛋蛋白质中同种氨基酸含量，A、B、C、…、I为待评价蛋白质的必需氨基酸含量，AE、BE、CE、…、IE为全鸡蛋蛋白质的必需氨基酸含量。单位均为mg/g。n为比较必需氨基酸个数。

1.5 脂肪酸评价方法

采用致动脉粥样硬化指数(IA)和致血栓形成指数(IT)评价黑斑蛙肌肉脂肪酸品质[14]。

式中，Ca为十二烷酸，Cb为十四烷酸，Cc为十六烷酸，m为多不饱和脂肪酸，p为高不饱和脂肪酸，Cd为十八烷酸，pa为n-6高不饱和脂肪酸，pb为n-3高不饱和脂肪酸。

1.6 数据处理

原始数据经Excel 2007整理后，使用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，显著性水平为0.05，统计数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 一般营养成分测定结果

野生黑斑蛙水分含量高于养殖黑斑蛙，粗蛋白、粗脂肪和灰分含量略低于人工养殖黑斑蛙，但差异均不显著(P>0.05)(表1)。这与Cagiltay等[15]对野生与养殖泽蛙(R.ridibunda)肌肉营养成分研究结果相同。

表1 野生与养殖黑斑蛙肌肉的一般营养成分(湿质量) % >

2.2 氨基酸组成

野生和养殖黑斑蛙肌肉氨基酸组成见表2(色氨酸破坏未测)。由表2可知，黑斑蛙肌肉含有17种常见氨基酸，其中7种必需氨基酸，2种半必需氨基酸、8种非必需氨基酸。野生黑斑蛙肌肉谷氨酸含量显著高于人工养殖，而酪氨酸及芳香族氨基酸含量显著低于人工养殖(P<0.05)。除谷氨酸和酪氨酸外，野生与养殖黑斑蛙肌肉其他15种氨基酸含量差异均不显著(P>0.05)。野生黑斑蛙肌肉的必需氨基酸仅有苏氨酸，非必需氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸高于养殖黑斑蛙，其他氨基酸含量则略低于养殖黑斑蛙。

表2 野生和养殖黑斑蛙肌肉氨基酸组成(干物质基础) %

注：*:必需氨基酸; ★:半必需氨基酸; #:鲜味氨基酸;◆:支链氨基酸;■:芳香族氨基酸.同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05).下同.

17种氨基酸在野生与养殖黑斑蛙肌肉中含量高低顺序相同，含量最高均为谷氨酸(15.04%，13.95%)，其次是天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸，含量最低的为胱氨酸(0.21%，0.21%)。

野生黑斑蛙的总氨基酸、非必需氨基酸、鲜味氨基酸总含量高于养殖黑斑蛙，而必需氨基酸、半必需氨基酸、支链氨基酸和芳香族氨基酸总含量低于人工养殖。野生黑斑蛙鲜味氨基酸/总氨基酸为32.31%，相比养殖黑斑蛙(30.90%)要高，其他氨基酸比值均低于养殖黑斑蛙。

2.3 氨基酸营养品质评价

将黑斑蛙肌肉必需氨基酸百分含量换算成每克氮中含氨基酸毫克数，与联合国粮农组织/世界卫生组织制定的蛋白质评价氨基酸标准模式及全鸡蛋蛋白质氨基酸模式相比较，计算得出氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数(表3)。由表3可知，养殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸含量为2261.90 mg/g，高于联合国粮农组织/世界卫生组织模式(2190 mg/g)，低于全鸡蛋蛋白质模式(2959 mg/g)。而野生黑斑蛙肌肉中必需氨基酸含量为2180.64 mg/g，均低于两种氨基酸模式。养殖与野生黑斑蛙肌肉赖氨酸含量(503.75、491.88 mg/g)均高于两种氨基酸评价模式(340、441 mg/g)。

表3 野生和养殖黑斑蛙肌肉中必需氨基酸与联合国粮农组织/世界卫生组织模式及鸡蛋蛋白标准模式比较 mg/g

野生与养殖黑斑蛙肌肉中除蛋氨酸+胱氨酸外，其他各必需氨基酸的氨基酸评分均大于0.85，化学评分均大于0.65(表4)，而且养殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸除苏氨酸之外，氨基酸评分和化学评分均比野生黑斑蛙要高，说明养殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸组成比例相比野生黑斑蛙更接近标准，营养价值更高。

氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数是比较分析动物肌肉必需氨基酸组成、评价蛋白质营养价值的主要指标。根据氨基酸评分来判断，野生与养殖黑斑蛙第一限制性氨基酸是蛋氨酸+胱氨酸，第二限制性氨基酸则分别为缬氨酸和苏氨酸；由化学评分可见，野生与养殖黑斑蛙第一和第二限制性氨基酸分别为蛋氨酸+胱氨酸、缬氨酸。养殖黑斑蛙肌肉必需氨基酸指数为72.42，高于野生黑斑蛙的70.25。

表4 野生和养殖黑斑蛙肌肉的必需氨基酸组成评价

注：a.第一限制性氨基酸；b.第二限制性氨基酸.

2.4 脂肪酸组成与评价

野生和养殖黑斑蛙肌肉脂肪酸组成较为相似，均含有28种脂肪酸，其中包含11种饱和脂肪酸、8种单不饱和脂肪酸和9种多不饱和脂肪酸(表5)。从脂肪酸含量来分析，野生和养殖黑斑蛙均为单不饱和脂肪酸>多不饱和脂肪酸>饱和脂肪酸，其中野生黑斑蛙肌肉中饱和脂肪酸含量显著高于养殖黑斑蛙(P<0.05)，而两者间单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量差异不大(P>0.05)。野生与养殖黑斑蛙各脂肪酸中相对含量最高的均为油酸(C18:1n9)(37.48%，35.86%)，其次为亚油酸(C18:2n6)(21.60%，21.74%)，再次为棕榈酸(C16:0)(12.73%，12.53%)。养殖黑斑蛙二十碳五烯酸(C20:5n3)和二十二碳六烯酸(C22:6n3)的含量分别比野生黑斑蛙高出15.1%和21.2%(P>0.05)，必需脂肪酸和花生四烯酸(C20:4n-6)的含量也分别比野生黑斑蛙高出1.41%和11.1%，但野生和养殖样本间差异不显著(P>0.05)。除了二十三碳酸(C23:0)和饱和脂肪酸的含量差异显著(P<0.05)外，其他脂肪酸含量在野生和养殖黑斑蛙之间差异均不显著(P>0.05)。

野生和养殖黑斑蛙肌肉n-6与n-3多不饱和脂肪酸含量的比值分别为2.6∶1和2.3∶1。除此之外，野生与养殖黑斑蛙肌肉的致动脉粥样硬化指数分别为0.21和0.21，致血栓形成指数分别为0.27和0.26。

表5 野生和养殖黑斑蛙肌肉脂肪酸组成 %

注：SFA，饱和脂肪酸；MUFA，单不饱和脂肪酸；PUFA，多不饱和脂肪酸；EFA，必需脂肪酸；IA，致动脉粥样硬化指数；IT，致血栓形成指数.

2.5 矿物元素含量及营养评价

野生与养殖黑斑蛙肌肉矿物元素含量见表6。常量元素中，野生黑斑蛙钾和钠含量比养殖黑斑蛙分别高出3.98%和22.8%，镁和钙含量则比养殖黑斑蛙分别低了17.3%和68.4%；微量元素中，野生黑斑蛙锌和铝含量分别低于养殖黑斑蛙20.9%和21.7%，差异显著(P<0.05)，硒含量则显著高于养殖黑斑蛙(P<0.05)。野生与养殖黑斑蛙重金属砷含量分别为0.07 mg/kg和0.03 mg/kg，铅含量分别为0.05 mg/kg和0.04 mg/kg，镉含量分别为0.001 mg/kg和0.002 mg/kg，汞未检出，均在GB 2762规定的允许范围内。

表6 野生和养殖黑斑蛙肌肉矿物质元素含量 mg/kg

3 讨 论

3.1 黑斑蛙常规营养成分与其他蛙类的比较

蛋白质是食物诸多营养素中首要的，也是机体结构功能不可或缺的基础营养素。本试验研究表明，黑斑蛙粗蛋白含量高于棘胸蛙(R．spinosa)[16]、食用蛙(R．esculenta)[17]、中国林蛙(R．chensinensis)[18]、牛蛙(R．catesbeiana)[19]、棘腹蛙(R.boulengeri)[20]、桑植趾沟蛙(R．sangzhiensis)[21]，略低于中国虎纹蛙(R．tigrina)[22]；黑斑蛙粗脂肪含量低于食用蛙[17]、桑植趾沟蛙[21]、中国虎纹蛙[22]等蛙类，也远低于常见经济淡水鱼类鲫鱼(Carassiusauratus)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、乌鳢(Ophiocephalusargus)、鳜鱼(Sinipercachuatsi)和鳊鱼(Parabramispekinensis)[23]。由此可见，黑斑蛙是一种蛋白质含量较高、脂肪含量较低的经济蛙类。野生黑斑蛙除水分高于养殖黑斑蛙外，粗蛋白、粗脂肪和灰分含量均低于后者。

3.2 野生和养殖黑斑蛙氨基酸组成分析及营养品质评价

氨基酸特别是必需氨基酸含量的高低与比例，能够与人体的8种必需氨基酸相吻合，营养价值才高，易被人体吸收利用[24]。由试验结果可知，野生与养殖黑斑蛙肌肉中总氨基酸含量(分别为80.99%和80.78%)和必需氨基酸含量(39.27%和40.41%)很高，均高于中国林蛙、棘胸蛙、牛蛙、棘腹蛙和中国虎纹蛙。有研究表明，野生水生动物肌肉的总氨基酸和必需氨基酸含量会高于养殖群体，如银鲳(Pampusargenteus)[25]，即使投喂商品配合饲料，野生草鱼肌肉总氨基酸和必需氨基酸含量仍显著高于人工养殖草鱼[26]，分析认为可能是配合饲料品质低于野生群体摄食天然饵料；也有研究指出，养殖1龄的红鳍东方鲀(Takifugurubripes)[24]肌肉总氨基酸和必需氨基酸含量均显著高于野生1龄的含量，原因可能是养殖红鳍东方鲀摄食冰鲜鱼，营养成分组成接近天然饵料，饵料数量较野生环境充足，因此营养物质积累相对优于野生群体。本试验中，野生黑斑蛙肌肉中总氨基酸含量高于养殖黑斑蛙，而必需氨基酸含量则低于养殖群体。动物蛋白质的鲜味在一定程度上取决于鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)的组成和含量[27]，而谷氨酸是一种重要的风味氨基酸，能够改善肌肉营养组成，具有浓烈鲜味[28]。试验结果表明，野生黑斑蛙肌肉谷氨酸的含量显著高于养殖黑斑蛙，鲜味氨基酸总量也高于养殖黑斑蛙，说明野生黑斑蛙肌肉相比养殖黑斑蛙味道更鲜美。

按照联合国粮农组织/世界卫生组织建议的理想模式，质量较好的蛋白质氨基酸组成中必需氨基酸/总氨基酸比值应约为40%，而必需氨基酸/非必需氨基酸应在60%以上[29]。试验结果表明，野生和养殖黑斑蛙肌肉氨基酸组成均远超过上述指标要求，属于优质食物蛋白源。必需氨基酸指数以全鸡蛋蛋白质必需氨基酸作为评价标准，是评价蛋白质营养价值的常用指标之一，指数值越高，说明氨基酸组成越平衡，蛋白质利用率越高[23,25]。野生黑斑蛙必需氨基酸指数为70.25，略低于养殖黑斑蛙的72.42，远高于虎纹蛙(Hoplobatrachusrugulosa)的43.83[27]，说明黑斑蛙肌肉必需氨基酸组成较为平衡。野生和养殖黑斑蛙肌肉赖氨酸含量很高(分别为7.87%和8.06%)，远高于虎纹蛙[27]、牛蛙[19]、棘胸蛙[16]。从本试验可知，野生和养殖黑斑蛙的主要限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸和缬氨酸，因此在饲料配方的调整过程中需要注意这些氨基酸的补充与平衡。

3.3 野生和养殖黑斑蛙脂肪酸组成分析及营养品质评价

野生和养殖黑斑蛙肌肉脂肪组成均为单不饱和脂肪酸>多不饱和脂肪酸>饱和脂肪酸。饱和脂肪酸中以棕榈酸含量最高，硬脂酸C18:0次之。前者能降低血清胆固醇，有一定保护胰岛素功能[30]，后者能够减少肠道胆固醇吸收从而降低肝脏中胆固醇含量[31]。单不饱和脂肪酸适量摄入对改善高血压人群效果明显，能有效降低低密度脂蛋白水平和冠心病发生率[32]。野生黑斑蛙中单不饱和脂肪酸含量最高为油酸，高达37.48%，比养殖黑斑蛙油酸含量要高，这与于久翔等[24]对红鳍东方鲀报道相同。油酸可降低血液总胆固醇和有害胆固醇，对人体具有重要的营养和保健功能[33]。养殖黑斑蛙n-3脂肪酸含量高于野生黑斑蛙15.15%，这与泽蛙研究报道相类似[15]，可能是由于野生与养殖蛙食物饵料来源组成不同所致。野生与养殖黑斑蛙肌肉二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸含量分别为6.57%和7.84%，均高于中国林蛙[18]和泽蛙[15]。

必需脂肪酸是人类身体的重要元素，且自身无法合成，必须从食物中获取。黑斑蛙肌肉富含人体所必需的3种脂肪酸，如亚油酸、亚麻酸(C18：3)和花生四烯酸。特别是人体不能合成的亚油酸，野生与养殖黑斑蛙含量较高，分别为21.60%和21.74%，远高于泽蛙(8.4%)[15]、虎纹蛙(12.3%)[27]、中国林蛙(13.4%)[18]和7种淡水经济鱼类[23]。亚油酸能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化，减少心脑血管疾病发生。

致动脉粥样硬化指数和致血栓形成指数用于评价脂肪酸导致心脑血管疾病风险，值越大，危险性越高[14]。野生与养殖黑斑蛙肌肉脂肪致动脉粥样硬化指数和致血栓形成指数分别为(0.21，0.27)和(0.21，0.26)，显著低于猪肉(0.60，1.37)、羊肉(1.00，1.58)、牛肉(0.72，1.06)和野生岩原鲤(Procyprisrabaudi)(0.45，0.36)[36]，表明黑斑蛙肌肉脂肪酸诱发冠心病风险极低，具有良好的保健功能。

3.4 野生和养殖黑斑蛙矿物元素组成分析

矿物元素分析结果表明，野生与养殖黑斑蛙肌肉含有丰富的人体必需钾、钠、钙、镁、锌、硒等元素。矿物元素含量最高为钾，分别达到3915.00 mg/kg和3765.33 mg/kg，其次是钠，含量分别达490.93 mg/kg和399.33 mg/kg，均远高于食用蛙[17]、中国林蛙[18]、虎纹蛙[27]，与泽蛙[15]含量相近。钾和钠参与细胞生理代谢过程，起着调节机体水平衡和维持人体正常渗透压和血压的关键作用[37]。镁在野生与养殖黑斑蛙肌肉中的含量仅次于钾和钠，作为辅酶因子之一在能量代谢、蛋白合成、RNA和DNA合成，以及维持神经组织和细胞膜生物电位等方面起着重要作用[17]。野生黑斑蛙肌肉钙含量比养殖黑斑蛙减少68.44%，原因可能是摄食天然饵料钙元素含量相比配合饵料缺乏，摄食沉积量相应减少。钙离子除了在骨骼生长发育起重要作用外，还参与多种酶的活化和细胞信号传导。

野生与养殖黑斑蛙肌肉微量元素排序相同，铁含量最高，其次是锌、铝、硒、铜。野生黑斑蛙肌肉中铝显著低于养殖黑斑蛙，这一结果同野生与养殖黑线鳕(Melanogrammusaeglefinus)[38]脊椎铝含量报道相一致，与黑线鳕肌肉铝含量相反，可能是因为硅作为应对急性铝中毒的重要元素，黑线鳕在脊椎中与硅协同作用从而蓄积了更多的铝。

4 结 论

野生和养殖黑斑蛙肌肉蛋白质含量高，脂肪含量低，氨基酸组成合理，必需氨基酸与总氨基酸及非必需氨基酸的比值高于联合国粮农组织/世界卫生组织推荐优质蛋白质氨基酸模式；游离氨基酸中鲜味氨基酸含量丰富，占氨基酸总量比例高，赋予肌肉浓郁的鲜美风味。野生和养殖黑斑蛙肌肉含有丰富的不饱和脂肪酸和必需脂肪酸，致动脉粥样硬化指数和致血栓形成指数较低，对人体膳食脂肪健康与平衡具有重要帮助。此外，黑斑蛙肌肉中含有丰富的钾、钠、镁、钙、铁、锌等矿物元素，参与重要的生理作用。因此，黑斑蛙是平衡膳食营养结构的优质来源，是一种营养价值高、味道鲜美的保健食品，而且养殖黑斑蛙肌肉营养品质接近并且部分指标优于野生黑斑蛙，具有良好的开发利用与人工养殖前景。