雌激素与雷洛昔芬治疗骨关节炎的实验研究*

徐晓李兴福欧阳侃熊建义黄俊锋王大平**段莉**

（1.广州医科大学，广州511436；2.深圳市第二人民医院组织工程重点实验室，广东深圳518035；3.汕头大学医学院，广东汕头515063）

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）又名绝经期后关节炎。在40岁以上人群中高发，女性患者数量明显高于男性，且与绝经后女性体内雌激素水平的下降有直接联系。相关研究[1,2]已经证实，雌激素水平与OA发病存在联系，关节软骨也存在相应的雌激素受体。关节软骨是雌激素的靶组织之一。雌激素补充治疗（hormone replacement therapy,HRT）临床也已经开展。雷洛昔芬是一种选择性雌激素受体调节剂，可促进成骨细胞的成骨作用，亦可抑制破骨细胞的骨吸收作用。临床使用雷洛昔芬主要用于预防和治疗妇女绝经期的骨质疏松症。目前对于雷洛昔芬在OA治疗方面的研究较少。构建合适的动物模型对于OA药物治疗方面的研究尤为重要。本文通过构建大鼠OA模型，比较雌激素与雷洛昔芬在OA治疗方面的差异，旨在为优化OA治疗方案提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物分组、造模及给药

6月龄雌性SD大鼠42只，由广州中医药大学实验动物中心提供。适宜环境、温度、湿度饲养一周后准备动物实验。按照随机分配的原则分为两组，每组21只。分别为自然组和造模大鼠组。造模大鼠组行卵巢切除术（ovariectomy,OVX）和半月板失稳术（destabilization of the medial meniscus,DMM），自然组仅相应部位切开皮肤后缝合。详细手术方法：通过腹腔注射水合氯醛水溶液（40 mg/kg）实施麻醉，常规消毒后，铺单，从背侧入路取双侧肋脊角下1.5 cm纵行切开皮肤、肌肉，进入腹腔，提拉出脂肪垫及卵巢，结扎卵巢动静脉、输卵管，切除双侧卵巢。膝关节内侧入路切开皮肤及关节腔，髌骨后外翻并膝关节屈曲，松解内侧副韧带并眼科剪切除内侧半月板。逐层缝合后送回鼠笼。术后密切观察大鼠生命体征。常规饲养两个月后，Micro-CT扫描大鼠膝关节，判断大鼠OA模型是否构建成功。大鼠OA模型构建成功后，按照随机分配的原则，从自然组随机抽取7只大鼠，组成空白对照组。造模大鼠组随机分为OA模型组，雌激素补充组和雷洛昔芬注射组，每组各7只大鼠。自然组和OA模型组每天皮下注射等量生理盐水，雌激素补充组和雷洛昔芬注射组每天分别皮下注射对应药物，雌激素（0.1 mg/kg），雷洛昔芬（3 mg/kg）。

1.2 Micro-CT扫描

药物持续注射一个月后，脱颈处死，去除膝关节周围毛发及部分肌肉，离断股骨中段及胫腓骨中段，获得大鼠离体膝关节，放置于10%中性福尔马林中固定72 h。使用Micro-CT扫描大鼠离体膝关节，PANalytical微焦点X线球管扫描，参数设置为18µm，60 KV，385µA，并在180°的范围内进行每次0.5°的旋转。以大鼠离体膝关节股骨与胫腓骨连线为长轴，关节囊中点为中心进行扫描，之后使用1.6版本的NRecon软件进行三维重建、制图并手工对感兴趣区（regions of interest,ROI）进行绘制，分析骨小梁数量（trabecular number,Tb.N）及骨小梁分离度（trabecular separation,Tb.Sp）等骨组织形态计量学指标。

1.3 组织切片

弱碱性脱钙1个月后，经脱水、石蜡包埋后，制作切片，随后用苏木精-伊红染色，在光镜下观察膝关节软骨形态变化。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，方差检验齐性后，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

整个实验过程中，全部大鼠均无感染，无意外死亡。两个月后发现造模大鼠组后肢均出现跛行。所有大鼠数据均进入最终结果分析。

2.1 Micro-CT扫描结果

造模手术2个月后，OA模型组大鼠Micro-CT扫描结果可见软骨周围骨质增生明显，软骨下骨原有结构破坏严重。软骨与软骨下骨作为一个有机统一的整体，共同参与膝关节的承重功能。因此OA中，软骨的退变可通过软骨下骨反映。OA模型组大鼠正位片出现的特征性改变，说明OA模型构建成功。

持续给予药物皮下注射1个月后，空白对照组软骨下骨Tb.N高于OA模型组、雌激素补充组、雷洛昔芬注射组（P＜0.01）；OA模型组、雌激素补充组、雷洛昔芬注射组软骨下骨Tb.N差异无统计学意义（图1）。

空白对照组软骨下骨Tb.Sp低于OA模型组、雌激素补充组、雷洛昔芬注射组（P＜0.01）；OA模型组、雌激素补充组、雷洛昔芬注射组软骨下骨Tb.Sp差异无统计学意义（图2）。

图1治疗1个月后，4组大鼠膝关节软骨下骨骨小梁数量比较

2.2 组织切片结果

大鼠膝关节软骨组织切片苏木精-伊红染色显示，空白对照组关节软骨层次清晰，细胞形态正常，基质着色均匀；OA模型大鼠膝关节关节基质已完全破坏，各层次结构紊乱无序，无法辨认；雌激素补充组，关节原有结构维持尚可，染色均匀，细胞数量稍增多，排列略紊乱，软骨面略粗糙；雷洛昔芬注射组大鼠膝关节关节基质原有结构破坏，软骨层变薄，染色不均，排列紊乱，软骨面粗糙（图3）。

3 讨论

骨关节炎是临床工作中的常见病和高发病。据统计，我国65岁以上人群中，OA的发病率达50%，75岁以上人群中OA患病率达85%[3]。随着全球老龄化人口逐年增长，已有学者[4]推测，OA极有可能成为全球第四大致残性疾病。OA发病呈现性别差异，绝经期后的女性患者远多于男性患者。随后的研究[5-7]发现，女性OA患病率的增加与体内雌激素水平的下降趋势相同。现已证实，雌激素通过与软骨上的雌激素受体结合，直接参与软骨细胞生理行为的调控。国外学者研究发现，关节软骨也能自主合成雌激素[8]，并通过与其受体作用，增强雌激素受体的敏感性，进而调节雌激素对软骨细胞的影响[9]。雌激素也参与调节关节中各种生物活性因子，进而对关节软骨的生理结构和功能产生影响[10,11]。本研究结果发现大鼠切除卵巢2个月后，大鼠行走出现跛行，组织切片结果可见软骨层原有结构破坏，进一步证实雌激素水平的下降可引发OA。

图2治疗1个月后，4组大鼠膝关节软骨下骨骨小梁分离度比较

在构建鼠类OA模型方面，目前常用的造模方法有3类：①关节内手术[12-14]；②关节内药物注射[15-17]；③基因敲除模型。因为半月板的切除及韧带的离断并没有直接对软骨产生破坏，由此产生的软骨病变类似OA模型早期，极适合药物治疗方面的研究，所以本次实验选用的是OVX+DMM的方式进行造模。通过OVX+DMM的手术方式，选取6月龄SD大鼠成功构建了OA模型，说明OVX+DMM是一种可靠、快速的造模方式。

雌激素在软骨细胞正常生理功能维持中扮演重要角色[18]。因此临床中也开展了HRT疗法[19]，但是雌激素的长期补充会带来明显的不良反应，甚至引起乳腺癌等恶性疾病的发生。进一步的研究[20]发现，雌激素受体有α和β 2种亚型，雌激素与不同的受体亚型结合，可产生不同的效果。基于雌激素受体功能性的差异，人工合成选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulator,SERMs）也逐步用于临床[21]。目前已经研发出多种SERMs,可以特异性的结合对应的α或β受体，引起不同的作用[21]。其中典型的SERMs代表就是雷洛昔芬。雷洛昔芬可以特异性结合雌激素受体α，在骨组织起雌激素样作用，在生殖系统起抗雌激素作用[22]。作为一种较为理想的SERMs，雷洛昔芬已广泛用于预防和治疗绝经后妇女的骨质疏松症[23]。但是，目前国内外关于雷洛昔芬能否治疗OA的研究开展较少。

Lories等[24]提出骨-软骨复合体这一概念后，越来越多的研究发现膝关节内的软骨、软骨下骨等多种组织结构共同参与OA发生发展[25,26]。因此，本次研究设想，能否通过使用雷洛昔芬来治疗OA，无论是从雷洛昔芬在治疗软骨下骨骨质疏松的角度，还是雷洛昔芬直接作用于软骨细胞。本次研究结果尚未发现雷洛昔芬在OA领域的治疗作用。Micro-CT结果显示，大鼠软骨下骨产生骨质疏松后，给予雷洛昔芬治疗，并不能使骨质疏松程度减轻。组织切片结果也提示，雷洛昔芬对于软骨退变没有治疗作用。当大鼠去势后，体内雌激素水平迅速下降。去势手术2个月后，软骨下骨出现了明显的骨质疏松。补充雌激素后，软骨下骨骨质疏松情况并未改善，而组织切片显示大鼠膝关节软骨退变明显好转。本次研究发现雌激素是直接作用于软骨发挥保护作用，并不是先对软骨下骨发挥作用。而Zhen等[27]研究发现，软骨损伤可引起软骨下骨结构改变，形成一个类骨质岛，从而使软骨下骨上的软骨张力增加，诱发软骨发生进一步的病理学改变。这表明，临床医师通过补充雌激素来治疗骨关节炎，也仅是暂时性的减缓了关节软骨退变，由于软骨下骨结构已经破坏，一旦终止补充雌激素，软骨由于没有了软骨下骨的支撑及营养，又快速退变而再次产生OA。此外，雌激素本身的特性导致OA患者无法长期持续补充雌激素。同时，本次实验发现，临床常用药物雷洛昔芬，作为一种选择性雌激素受体调节剂，对OA没有治疗作用。

图3各组膝关节软骨苏木精-伊红染色（上40×，下100×）

综上，本次研究表明，OVX+DMM是一种快速有效的造模方式，可以在大鼠OA药物研究领域推广。雌激素对于大鼠骨关节炎有治疗作用，仅表现在治疗软骨退变，对于软骨下骨的骨质疏松并无改善。临床常用选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬对大鼠骨关节炎没有治疗作用。雌激素治疗OA又存在诸多的不足及副作用，因此，亟须研发新型选择性雌激素受体调节剂，用于高效、特异性治疗OA。