针药联合疗法对糖尿病大鼠肾功能的影响*

薛 娣

(南阳医学高等专科学校基础医学部，河南 南阳 473000)

糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常见的一种并发症，常引起肾功能衰竭，是患者致死的主要原因。中医学认为糖尿病以阴虚为本、燥热为标，治疗多采用滋阴清热、生津、滋肾等方法[1-3]。近年来，针刺、艾灸等方法治疗糖尿病取得了较好的疗效[4-7]。研究报道，针药结合在糖尿病的治疗及其并发症的防治方面具有较好的效果[6-8]。本研究采用针刺加补气化瘀中药的联合方法治疗糖尿病肾病大鼠，通过观察大鼠空腹血糖(fastingblood-glucose,FBG)、血肌酐(serumcreatinine，SCr)、尿肌酐(urinecreatinine，UCr)、内生肌酐清除率(creatinineclearance,Ccr)、一氧化氮(nitricoxide，NO)、一氮化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)、转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1) 等指标，研究其对糖尿病大鼠肾脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

雄性SD大鼠，50只，清洁级，3月龄，体质量150～200g，购于郑州大学实验动物中心，许可证号：SCXK豫2010-0002。将大鼠喂养在室温20～25 ℃的清洁级动物房内，普通饲料喂饲，自由饮水。

1.2 药品、试剂与仪器

补气化瘀药物处方组成：黄芪12g，赤芍25g，当归20g，红花15g，川芎15g，地龙20g，桃仁15g。药材购自河南省医药药材有限公司，水煎制剂浓缩至每毫升药液含生药1g，高压灭菌后存放于4 ℃冰箱内备用。链脲佐菌素(STZ)，Sigma公司产品，批号20120907；TGF-β1多克隆抗体，北京博奥森生物科技有限公司产品，批号20150219；血糖测定试剂盒，南京建成生物工程公司产品，批号20141209。血糖测试仪，南京建成生物工程公司产品；G6805-2A型低频电针仪，上海华谊医用仪器有限公司产品；PUZS-300全自动生化分析仪，北京普朗新技术有限公司产品。

1.3 动物分组与模型的建立

喂养大鼠1周后, 将其随机分为正常对照组、模型对照组、电针组、药物组和针药联合组5组，每组10只[4]。禁食、不禁水12h后，除正常对照组外，其余4组均一次性腹腔注射STZ60μg/g建立糖尿病模型；正常对照组注射等体积柠檬酸缓冲液。48h后采用葡萄糖氧化酶法测血糖，血糖≥16.9mmol/L为糖尿病造模成功。

1.4 给药方法

造模成功后第7天，正常对照组、模型对照组予生理盐水0.015mL/g灌胃，1d1 次；药物组给予补气化瘀药物0.015mL/g灌胃，1d1 次；电针组给予电针治疗[5](强度1mA，频率160～180次/min)，取穴足三里、内庭，每次30min，1d1 次；针药联合组采用电针和补气化瘀药物相结合的联合疗法。各组均连续治疗6周。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况

药物干预结束后观察大鼠的一般情况，包括体质量、毛色、精神状态、饮食等。

1.5.2FBG、NO、UCr、SCr和Ccr

FBG测定：治疗停止前1d尾静脉采血，采用血糖测试仪测量FBG。

NO、UCr测定：治疗停止前1d收集24h尿液，用全自动生化分析仪检测NO、UCr。

SCr测定：治疗停止24h后，以质量分数为50g/L的水合氯醛10μL/g腹腔注射麻醉, 心脏取血, 分离血清， -20 ℃保存备用。采用生化分析仪检测SCr。

Ccr测定：根据生化检测数值计算Ccr数值。Ccr=尿肌酐浓度(mg/L)×尿量(L/24h)/血浆肌酐浓度(mg/L)

1.5.3 肾脏肥大指数

心脏取血后处死大鼠，取双侧肾脏，清洗干净，用滤纸吸干肾表面血液，称量质量并计算肾脏肥大指数，甲醛固定，备用[7]。肾脏肥大指数=双侧肾质量总和(g) /体质量(kg) × 100%

1.5.4 肾组织病理改变和肾小球TGF-β1表达

取甲醛固定24h的肾组织，流水冲洗，用体积分数为70，80，90，95，100mL/L的乙醇梯度依次脱水各30min，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片(厚度约为2μm)，苏木苏-伊红(hematoxylin-eosin，HE)、过碘酸-希夫(periodicacidschiff，PAS) 染色，光镜下观察肾组织病理改变。免疫组织化学法测定TGF-β1表达。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况对比

正常对照组大鼠精神状态良好，毛发光泽，行动敏捷。模型对照组大鼠精神萎靡，毛发干枯、发黄，行动迟缓，多饮、多食、多尿、体质量减轻的“三多一少”症状明显。药物组、电针组及针药联合组大鼠的一般状态均较模型对照组有不同程度的改善。

2.2 各组大鼠FBG、SCr、UCr和Ccr对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠FBG、SCr、和Ccr均升高,UCr降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，药物组、电针组和针药联合组大鼠FBG、SCr、和Ccr均降低,UCr升高，差别有统计学意义(P<0.05)。与药物组和电针组分别对比，针药联合组大鼠FBG、SCr、Ccr均下降，UCr升高，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1 。

组 别nFBG/(mmol·L-1 )SCr/(μmol·L-1 )UCr/(mmol·L-1 )Ccr/(mL·min-1 )正常对照组106.7±0.7148.1±3.2329.12±5.20.5±0.095模型对照组1023.5±2.23∗58.7±4.15∗7.42±4.11∗1.32±0.246∗药物组1018.4±3.59#54.8±4.13#13.13±5.45#0.83±0.225#电针组1019.1±3.61#54.6±4.13#11.83±4.66#0.91±0.21#针药联合组107.8±2.94#△▲50.7±4.04#△▲23.41±1.32#△▲0.62±0.167#△▲

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05；与药物组对比，△P<0.05；与电针组对比，▲P<0.05

2.3 各组大鼠肾脏肥大指数、NOS、NO和NO/ET对比

与正常对照组对比，模型对照组肾脏肥大指数、NOS水平和NO活性升高，NO/ET降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，药物组、电针组和针药联合组大鼠肾脏肥大指数、NO水平和NOS活性均显著降低，NO/ET明显升高，差别有统计学意义(P<0.05) 。与药物组及电针组分别对比，针药联合组肾脏肥大指数、NOS水平和NO活性均降低 ，NO/ET升高，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组 别n肾脏肥大指数/10-3NOS /( ng·L-1 )NO/(μmol·L-1 )NO/ET /( ng·L-1 )正常对照组104.11±0.320.15±0.031.12±0.090.19±0.03模型对照组107.66±0.56∗0.34±0.02∗1.84±0.18∗0.08±0.03∗药物组105.14±0.36#0.24±0.05#1.42±0.21#0.11±0.03#电针组105.94±0.31#0.27±0.03#1.49±0.19#0.13±0.03#针药联合组104.61±0.52#△▲0.19±0.04#△▲1.19±0.23#△▲0.21±0.04#△▲

注：与正常对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05；与药物组对比，△P<0.05；与电针组对比，▲P<0.05

2.4 各组大鼠肾组织病理改变和肾小球TGF-β1表达对比

光镜下：正常对照组大鼠肾脏肾小球结构完整，肾小球毛细血管基底膜均匀，无增厚，未见肾小球肥大。模型对照组大鼠肾脏肾小球肿胀增大，肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜区增宽，肾小管肿胀明显[9]。药物组和电针组大鼠肾脏有不同程度的病理改变，但较模型对照组轻，表现为肾小球轻度肥大，少量的系膜细胞和基质的增多，肾小管肿胀不明显。与药物组、电针组对比,针药联合组肾小球体积明显减小，病理改变减轻。

与正常对照组对比，模型对照组大鼠TGF-β1表达明显增多，差别有统计学意义( P<0.05)。与模型对照组对比，药物组、电针组和针药联合组大鼠TGF-β1表达均降低，差别有统计学意义(P<0.05)。与药物组及电针组分别对比，针药联合组大鼠TGF-β1表达下降，差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3各组大鼠肾小球TGF-β1表达对比

组 别n吸光度值正常对照组100.39±0.12模型对照组100.81±0.02∗药物组100.45±0.03∗#电针组100.47±0.03#针药联合组100.40±0.02#△▲

注：与正常对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05；与药物组对比，△P<0.05；与电针组对比，▲P<0.05

3 讨 论

糖尿病肾病属中医学“消渴”并发“水肿”范畴，是一种以肾小球肥大、肾小球滤过减少、肾纤维化和肾功能损害为特征的慢性病。根据治病求本、兼治其标的中医治疗原则，中医药在临床症状改善率、降低SCr、改善肾功能等方面具有很大的优势，中医针法治疗糖尿病也取得了较好的疗效[4-7]。本研究采用针药联合治疗，发现其对糖尿病肾病大鼠有减轻肾脏损伤的保护作用。

NO为内皮细胞舒血管因子，可降低血管张力，造成肾细胞损害，促进炎症产生与发展[9]。NOS为一氧化氮合成酶，可促进NO的合成。研究发现，糖尿病肾病患者肾脏表达高水平内皮型NOS，激活NO活性，引起肾小球高滤过状态及系膜基质的增生[10]。因此NO作为血管活性物质参与了肾小球高灌注、高滤过的发生、发展和肾细胞的损伤。本实验中，模型对照组大鼠体质量下降，肾脏肥大指数、FBG、Ccr、SCr均显著升高，UCr数值降低，提示糖尿病大鼠肾脏功能受损。同时模型对照组大鼠肾脏肥大指数、NO水平和NOS活性升高较明显，NO/ET显著降低，表明此模型可能处于DN早期。针药联合治疗后，大鼠肾脏肥大指数显著降低，NO水平、NOS活性也降低，NO/ET却明显升高，证实针药联合治疗通过影响大鼠体内NO水平、NOS活性和NO/ET，使肾小球的高滤过降低，对早期DN肾脏起到保护作用。TGF-β是具有调节细胞生长、分化功能的活性多肽，机体内以TGF-β1含量最高。在肾脏中，TGF-β广泛分布于肾小管、肾小球与肾间质中，TGF-β在DN的发生与发展中扮演着非常重要的角色。实验结果显示：在DN发生早期，TGF-β1及TGF-β1mRNA表达就明显升高，血糖水平随着TGF-β1水平升高而升高[3]。细胞实验也显示TGF-β1具有诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的作用。RNA测序技术实验结果证实TGF-β1介导了肾纤维化和DN的发生、发展进程[13]。本实验结果显示：糖尿病模型组大鼠较正常对照组大鼠不仅血糖升高，而且Ccr升高、TGF-β1表达增多。提示糖尿病肾病的病理过程可能与这些因素的参与有关。针药联合组大鼠在6周的干预治疗后，FBG、SCr、Ccr均明显低于模型对照组，特别是TGF-β1表达显著降低，说明了针药联合治疗能够降低肾脏TGF-β1表达而使血糖水平降低，从而改善DN大鼠的肾脏功能。

综上所述，中医针药联合疗法可有效改善DN大鼠的肾功能并降低血糖水平，有望在治疗糖尿病及其并发症方面发挥重要作用。