盐酸小檗碱-磷脂复合物的处方工艺研究

王庆，刘黎瑶, ，通信作者，王庆奎

盐酸小檗碱-磷脂复合物的处方工艺研究

王庆a，刘黎瑶a, b，通信作者，王庆奎b

（天津农学院，a. 基础科学学院 生物制药系；b. 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

盐酸小檗碱是临床治疗胃肠道细菌感染等疾病的有效药物。但由于脂溶性差等问题，造成其口服生物利用度较低，难以充分发挥药效。本研究旨在利用磷脂复合技术提高盐酸小檗碱的脂溶性。通过溶剂-旋转蒸发法，以复合率（）为筛选指标，采用单因素筛选及正交设计，筛选得到制备盐酸小檗碱-磷脂复合物的最佳处方。优选处方下，盐酸小檗碱-磷脂复合率达到90%以上，4 ℃下可稳定保存3个月。该研究为盐酸小檗碱-磷脂复合物的后期应用奠定了物质基础。

盐酸小檗碱；磷脂复合物；正交设计；处方筛选

盐酸小檗碱作为中药黄柏、黄连中的有效成分，是临床治疗胃肠道细菌感染等疾病的有效药物。并且，有大量文献报道其在治疗肿瘤及心脑血管疾病方面有效性较高，具有较高的潜在开发价值[1-3]。但由于盐酸小檗碱的脂溶性极差，导致口服给药后的生物利用度较低，无法充分发挥药物治疗作用。在口服给予盐酸小檗碱时，如果要达到治疗心脑血管疾病的血药浓度，势必要增加给药剂量，继而产生诸多不良反应，如肠道菌群失衡、产生耐药性等[4-5]。因此，通过药物制剂技术构建适宜的递送载体来提高盐酸小檗碱的脂溶性，具有极大的应用前景和价值。

磷脂复合物通过药物和磷脂分子间的静电复合作用形成稳定的复合体，能够在不改变药物分子结构的前提下，极大程度地提高药物的脂溶性，在增加中药有效成分的口服生物利用度方面已有较深入的研究[6-8]。已有研究将盐酸小檗碱制备成磷脂复合物，但其复合时间长达2～4 h，而复合率基本在70%左右[9]。本研究中发现，辅助利用超声的方法能极大缩短复合时间，且通过复合溶剂筛选，选择适宜的复合溶剂条件，可大幅度增加复合率。经单因素筛选及正交设计，以盐酸小檗碱与大豆卵磷脂的复合率为筛选指标，对复合溶剂、超声复合时间以及投料比例进行了考察，优选复合处方工艺中，复合溶剂为甲醇-二氯甲烷系统，溶剂系统的最适pH值为6.0，超声复合时间为30 min，盐酸小檗碱与磷脂的投料质量比例为1∶1。按照优选处方所制备的盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率达到90%以上。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

电子天平（Sartorius，BSA 223S）；超声波清洗仪（昆山禾创仪器有限公司，KH5200B型）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；旋转蒸发仪（Rotavapor R-100，BUCHI）；微孔滤膜等。

1.2 试剂

盐酸小檗碱（西安奥赛生物科技有限公司，纯度99%）；盐酸小檗碱标准品（中国药品生物制品检定院，HPLC≥98%）；大豆磷脂（上海艾伟拓医药科技有限公司，纯度98%）；无水乙醇、正己烷、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷（天津市风船化学试剂有限公司，分析纯）；磷酸、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 盐酸小檗碱-磷脂复合物的制备方法

分别称取适量盐酸小檗碱与大豆卵磷脂置于烧杯中，加入适宜溶剂分别溶解后，混合并振摇均匀。置于超声条件下进行复合反应。超声复合结束后，减压蒸发多余溶剂，即得干燥的黄色固体盐酸小檗碱-磷脂复合物。

2.2 盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率测定方法建立

2.2.1 紫外-可见光区全波长扫描

称取盐酸小檗碱标准品10 mg置于容量瓶中，加入无水乙醇超声溶解并稀释至适当浓度后，使用紫外-可见分光光度计测定其在200～900 nm波长区域内的紫外-可见光吸收情况，并记录该区域内的扫描光谱图。根据全波长扫描光谱图选择含量测定的最适波长。

2.2.2 标准曲线绘制

准确称量盐酸小檗碱标准品10 mg置于容量瓶中，加入无水乙醇超声溶解并定容至10 mL，配制得到浓度为1 000 μg/mL的储备液。精密移取适量储备液，并使用无水乙醇稀释得到20、40、60、80、100 μg/mL梯度浓度的标准溶液。通过紫外分光光度法，在最适吸收波长条件下，测定上述系列标准溶液的吸光度。以标准溶液的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并通过最小二乘法拟合出线性回归方程。

2.2.3 精密度测定

取2.2.2部分低、中、高浓度的线性样品连续测定5次，测定其在最适波长下的吸光度，记录吸光度数值并计算相对标准偏差（RSD%）。

2.2.4 复合率的测定方法

利用盐酸小檗碱不溶于正己烷，而成功形成盐酸小檗碱-磷脂复合物后则易溶于正己烷的特性[10-11]，在样品制备结束后，称取适量样品置于烧杯中，加入适量正己烷溶解，经微孔滤膜过滤后，收集滤液并减压蒸发去除多余正己烷，使用无水乙醇溶解并稀释适宜倍数，于最适吸收波长条件下，测定其中盐酸小檗碱的吸光度，使用标准曲线的回归方程，计算复合物中盐酸小檗碱的含量。根据初始投料量（0）与复合物中盐酸小檗碱的质量（t）计算复合率（），计算公式为：（%）＝t/0×100%。

2.3 单因素影响试验

2.3.1 反应溶剂筛选

根据文献调研[8]和前期试验结果，本研究首先对复合反应的溶剂系统进行了筛选。设定了盐酸小檗碱与磷脂的投料比为1∶10（质量比例），超声复合时间为30 min。以盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为评价指标，对甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃进行考察，以筛选出最佳的反应溶剂。

2.3.2 溶剂系统pH值筛选

选定反应溶剂后，对该反应溶剂系统的pH值进行筛选，在筛选过程中，保持盐酸小檗碱与磷脂的投料比为1∶10（质量比例），超声复合时间为30 min。设定溶剂系统的pH值为2.0、4.0、6.0、8.0、12.0，以复合率为评价指标，筛选出反应溶剂系统的最佳pH值。

2.3.3 投料比例筛选

使用选定的反应溶剂，且在选定的pH条件下，保持超声复合反应30 min。以盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为评价指标，设定盐酸小檗碱与磷脂的投料比为1∶1、1∶3、1∶5、1∶10、1∶15（质量比例），对盐酸小檗碱与磷脂的投料比例（质量比例）进行筛选。

2.3.4 超声反应时间筛选

使用选定的反应溶剂，且在选定的pH条件及投料比例下，以盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为评价指标，设定超声时间分别为15、30、60、90、120 min，对复合过程的超声时间进行筛选。

2.4 正交设计试验

根据单因素筛选结果，选择最佳反应溶剂系统为甲醇-二氯甲烷，复合反应受到溶剂系统pH值（A）、盐酸小檗碱与磷脂的投料比例（B）、超声时间（C）的影响。因此，进行上述3因素3水平的正交试验，以复合率为指标筛选出最佳的处方工艺。正交设计因素水平表如表1所示。

表1 正交设计因素水平表

2.5 优化处方下复合物的放置稳定性

在优选的处方工艺下，制备3批盐酸小檗碱-磷脂复合物，分别测定其复合率，且于4 ℃条件下密封放置0、1、2、3个月，对该优选处方下放置稳定性进行评价。

3 结果与分析

3.1 盐酸小檗碱的含量测定方法

3.1.1 全波长扫描

按照既定试验方法，使用紫外-可见分光光度计测定盐酸小檗碱溶液在200～900 nm波长区域内的紫外-可见光吸收情况，并记录了该区域内的扫描光谱图，如图1所示。根据全波长扫描光谱图选择含量测定的最适波长为350 nm。

图1 盐酸小檗碱溶液的全波长扫描光谱图

3.1.2 标准曲线绘制

按照既定的试验方法，配制了不同浓度盐酸小檗碱标准品系列溶液，依法使用紫外分光光度法进行测定。结果表明：以吸光度Abs（纵坐标，）对浓度（μg/mL，横坐标，）进行线性回归，拟合得出的回归方程为＝0.008 9＋0.025 2（2＝ 0.999 8），盐酸小檗碱标准品系列溶液在0～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，如图2所示。

图2 盐酸小檗碱标准品系列溶液标准曲线

3.1.3 精密度测定

按照既定的试验方法，低、中、高浓度盐酸小檗碱标准品溶液的精密度测定结果如表2所示。

表2 精密度试验结果

注：为待测溶液在350 nm处的吸光度数值；为标准偏差；（%）为相对标准偏差

测定结果表明，对低、中、高浓度对照品溶液分别连续重复5次测定的值均小于2%，表明本法的精密度良好。

3.2 单因素影响试验

3.2.1 反应溶剂筛选

根据既定试验方法，以盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为评价指标，对甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃进行考察，以筛选出最佳的反应溶剂，筛选结果如图3所示。分析结果表明，使用甲醇-二氯甲烷的溶剂系统制备盐酸小檗碱-磷脂复合物时，复合率均高于其他几种溶剂，因此，在后续处方筛选中，均以甲醇-二氯甲烷作为反应溶剂。

图3 反应溶剂筛选结果

3.2.2 溶剂系统pH值筛选

根据既定试验方法，在筛选过程中保持盐酸小檗碱与磷脂的投料比为1∶10（质量比例），超声复合时间为30 min，并以甲醇-二氯甲烷作为复合溶剂。以复合率为评价指标，筛选出反应溶剂系统的最佳pH值，筛选结果如图4所示。分析结果表明，当反应溶剂系统的pH值从2.0升高至6.0时，复合率逐渐升高；pH为6.0时复合率达到最高，随后便开始降低。

图4 溶剂系统pH值的单因素筛选结果

3.2.3 投料比例筛选

根据既定试验方法，保持溶剂系统的pH值为6.0、超声复合反应为30 min条件下，以盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为评价指标，对盐酸小檗碱与磷脂的投料比例（质量比例）进行筛选，结果如图5所示。分析结果表明，随着磷脂用量的增加，复合率呈现出增长的趋势，并且在1∶10之后逐渐趋近于复合平衡，复合率基本达到90%左右。

图5 盐酸小檗碱与磷脂的投料比例（质量比例）单因素筛选结果

3.2.4 超声反应时间筛选

在选定的反应溶剂、选定的pH条件以及投料比例下，以盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为评价指标，对复合过程的超声时间进行筛选，筛选结果如图6所示。分析结果表明，当超声复合时间为15 min时，复合率达到80%左右；超声时间为30 min时，复合率达到90%；之后，随着超声时间增加，未见复合率进一步显著增加。

图6 超声复合时间的单因素筛选结果

3.3 正交设计试验

通过3因素3水平（L9，34）正交设计，以复合率作为评价指标，对溶剂系统pH值（A）、盐酸小檗碱与磷脂的投料比例（B）、超声时间（C）进行了正交筛选，得出制备盐酸小檗碱-磷脂复合物的最佳处方，正交分析结果如表3所示。

表3 处方筛选的正交试验结果

分析结果表明，在影响该磷脂复合物复合率的3大因素中，超声时间与投料比例对复合率的影响较大，其次是溶剂系统的pH值。通过正交极差分析得出最优的处方为A2B3C1，即溶剂系统的pH值为6.0、盐酸小檗碱与磷脂的质量比例为1∶15、超声时间为15 min。

3.4 优化处方下磷脂复合物的稳定性评价

按照最优处方条件制备了3批盐酸小檗碱-磷脂复合物，并且对其放置稳定性进行了初步性评价表征，结果如表4所示。考察结果表明，优选处方下，所制备的3批盐酸小檗碱-磷脂复合物的复合率为（91.3±2.38）%，外观呈黄色颗粒状。将上述3批复合物置于4 ℃条件下进行放置稳定性评价，结果表明优选处方下盐酸小檗碱-磷脂复合物放置3个月以内的稳定性良好，复合率以及盐酸小檗碱含量均未发生显著变化。

表4 盐酸小檗碱-磷脂复合物的放置稳定性评价（4 ℃）

4 讨论

从本质上看，磷脂复合物是以磷脂作为分散载体（或者分散介质），通过适宜的方法制备的一类固体分散体，其中，活性药物以无定形的状态均匀分散在分散载体中，能够显著改善难溶性药物的溶解性、溶解速度以及生物利用度[12-13]。根据药物的性质，可通过多种方法来制备磷脂复合物，包括冷冻干燥法、熔融法等[14-15]。本研究通过筛选适宜的复合溶剂系统，且联合使用超声及旋转蒸发法，与已有研究相比，大大缩短了制备时间，同时提高了复合效率，表现出较大的优势。

研究发现在盐酸小檗碱-磷脂复合物成型性的限制因素中，溶剂的pH值具有一定影响。事实上，在制备过程中发现：如果溶剂的pH值偏离6.0～7.0时，盐酸小檗碱-磷脂复合物基本不能复合成型，大量的盐酸小檗碱沉淀在底部，无法与磷脂溶液进行复合。这可能是由于改变pH值影响了盐酸小檗碱在有机溶剂中的溶解性，导致其无法在均一的溶液中以分子状态与磷脂分子发生复合作用。因此，提示在后续的研究中，有必要针对难溶性药物的溶解状态与复合率的关系进行相关研究。

本研究中，通过系统的处方筛选改良了盐酸小檗碱-磷脂复合物的处方工艺，缩短了复合时间的同时提高了复合效率，有望为其进一步应用提供理论基础，具有很大的发展空间以及实际应用价值，对于中药新剂型的构建和改进也具有一定的指导意义。

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Formulation optimization and research on berberine hydrochloride phospholipid complex

WANG Qinga, LIU Li-yaoa, b, Corresponding Author, WANG Qing-kuib

（Tianjin Agricultural University, a. Department of Biopharmaceuticals, College of Basic Science; b. Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

Berberine hydrochloride is effective medicine for gastrointestinal bacterial infection treatment clinically. However, as for its poor lipophilicity, oral bioavailability of beriberine hydrochloride is relatively low. This study was designed to increase the lipophilicity of berberine hydrochloride using phospholipid complexation technology. In this study, associative efficiency（） was set as screening parameter and optimal formulation of berberine hydrochloride phospholipid complex was obtained using solvent evaporation method based on single factor screening and orthogonal design. Under the selected formulation,of berberine hydrochloride phospholipid complex could reach 90% and storage stability remained in 6 months under 4 ℃, which provided the basis for practical application.

berberine hydrochloride; phospholipid complex; orthogonal screening; formulation optimization

R944.9

A

1008-5394（2019）02-0064-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.02.015

2019-01-03

天津市教委科研计划项目（2017KJ181）；天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017004）；国家自然科学基金面上项目（31170442）

王庆（1996-），男，本科在读，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：1051123854@qq.com。

刘黎瑶（1988-），女，讲师，博士，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail：llymeilin@163.com。

责任编辑：张爱婷