积雪苷软膏对BALB/C裸小鼠瘢痕疙瘩模型成纤维细胞及胶原蛋白表达的影响

杨 艳 郭桂珍 王卫涛 马春锋

瘢痕疙瘩(keloid)最显著的病理特征是成纤维细胞持续活化所产生的高水平的胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖等细胞外基质成分，尤其是胶原的过度堆积，从而导致真皮的持久纤维化[1]。积雪苷是萃取于天然药用植物积雪草的有效成分，因其具有抗炎作用，能抑制瘢痕形成而考虑将其用于瘢痕疙瘩的治疗，前期我们已经在细胞水平证实积雪苷能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并下调结缔组织生长因子(CTGF)的表达[2],现在我们建立了瘢痕疙瘩裸鼠模型,在稳定的内环境中观察外用积雪苷软膏对瘢痕疙瘩成纤维细胞及其胶原蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及标本来源 实验动物:BALB/C品系裸小鼠，SPF级，6～8周龄，共16只，雌雄不限，每只重20～23 g，由青岛农业大学实验动物中心提供。瘢痕疙瘩标本来源于城阳人民医院皮肤科瘢痕疙瘩患者(经医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书)，手术取材于前胸部及肩部瘢痕组织。患者年龄16～45岁，平均(30.53±7.19)岁。瘢痕疙瘩的诊断标准参照1992年Darzi诊断标准[3]。入选标准：2年内未接受药物注射、放疗或外科治疗，无系统疾病者。

1.2 主要试剂及仪器 积雪苷软膏由上海雷允上药业有限公司提供(浓度为0.00125%、0.0025%、0.005%)，兔抗人I型胶原多克隆抗体，克隆号BA0325(武汉博士德生物技术有限公司)，PV-9000非生物素通用型二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，LAB VISION自动免疫组化染色仪，透射电子显微镜(JEM-1230，JEOL Inc公司，Japan)。

1.3 建立动物模型及分组治疗 取6～8周龄,体重20～23 g/只,BALB/C裸小鼠,将外科手术切除的瘢痕疙瘩组织立即在无菌条件下切成8 mm×5 mm×5 mm大，植入裸鼠两侧肩胛部各一块及骶尾部一块。两周后，组织块存活，无感染及排斥现象，将16只瘢痕疙瘩裸小鼠随机分为四组，A组外用对照软膏基质，B组外用0.00125%积雪苷软膏，C组外用0.0025%积雪苷软膏，D组外用0.005%积雪苷软膏，屏障环境无菌条件下以棉签蘸药膏，顺时针方向均匀涂抹，每日三次，同时观察局部皮肤反应、组织变化、裸小鼠的全身情况。

1.4 组织病理检查 用药后6周取出所有植入的瘢痕疙瘩组织块，观察组织块形态，测量其体积，将之切分为两半，送透射电镜检查；送常规病理。

1.5 I型胶原蛋白免疫组化 采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，ELIVISON二步法进行染色。从自动免疫组化染色仪中取出已染色完毕的切片，苏木素复染，0.1%HCL分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥二甲苯透明，中性树胶封固。使用PBS代替一抗处理的切片作为空白对照，已知阳性组织切片作为阳性对照。结果判定：I型胶原的免疫组织化学评分采用半定量判断指标：每组24张切片，显微镜下，每张切片选择染色良好区域观察，随机取5个视野，由两位病理诊断医生双盲判读。高表达率切片呈棕黄色或棕褐色。根据胶原纤维着色面积及阳性染色强弱进行判断。着色强弱计分：未着色计分为0，淡黄色计分为1，棕黄色或棕褐色计分为2；着色面积计分：着色面积在10%以下计分为0，阳性面积在10%～25%计分为1，阳性面积在26%～50%计分为2，阳性面积在50%以上且着色较深计分为3。上述两项相加，≤1为阴性(-)，2为弱阳性(+)，3为中等阳性(++)，≥4为强阳性(+++)。统计学方法：实验数据以α=0.05为标准，应用Stata7.0统计分析软件，进行χ2检验，Fisher精确概率法计算。

1.6 透射电镜检查 将已修成1 mm3的瘢痕疙瘩组织块置预冷的4%戊二醛固定液中，固定2 h；在4℃下进行梯度脱水, 将脱水后样品进行浸透、包埋, 显微镜下用手术刀片修块；组织切片机上先切取数张2 μm厚的半薄切片，1% 甲苯胺蓝溶液染色，光镜下观察定位后在超薄切片机上超薄切片，厚度为70 nm左右，让其贴附在有支持膜的铜网上，柠檬酸钠-硝酸铅复染10 min，JEM-1230型透射电子显微镜下观察。

2 结果

2.1 肉眼观察 各组裸小鼠均存活，生活状态良好，饮食、大小便、体重增长、活动均正常。A组(对照组)用药至第六周时局部皮肤完好，组织块大小、硬度无明显变化；B组(0.00125%浓度组)用药两周后局部皮肤稍红,但无靡烂、破溃，继续用药后皮肤又恢复正常，用药至第六周时组织块平均体积稍缩小，质地中等；C组(0.0025%浓度组)用药两周后局部皮肤稍红，继续用药时可见小鼠抓挠用药处，三周时用药局部出现点状表皮缺损，组织块完好，继续用药至第六周时局部点状表皮缺损愈合，组织块平均体积缩小，表现为厚度变薄，3.5～4 mm，质地中至软；D组(0.005%浓度组)用药两周后局部皮肤稍红，继续用药时可见小鼠抓挠用药处，三周时用药局部出现点状表皮缺损，组织块完好，继续用药至第六周时局部点状表皮缺损未愈，组织块平均体积缩小，表现为厚度明显变薄，3～3.5 mm，质地中至软。见图1～6。

图1植入前的瘢痕疙瘩组织块图2A组6 w时组织块外观图3B组用药至6 w时组织块外观图4C组用药至3 w后局部出现点状表皮缺损，6 w后愈合图5D组用药6 w时取组织块图6C组用药后组织块体积缩小

2.2 光镜观察 用药6周后取瘢痕疙瘩组织块，常规HE染色，光镜下A组组织结构与移植前相似，可见成纤维细胞数较多，胶原纤维粗大，排列紊乱，边缘可见较多微血管；B组、C组、D组均可见成纤维细胞数明显减少，组织块边缘胶原纤维变细呈波浪状，排列整齐，部分中央胶原纤维仍粗大，呈结节、漩涡状，组织块边缘处有少量炎症细胞浸润。变化以C、D组为明显。见图7、8。

2.3 I型胶原蛋白免疫组织化学染色 染色结果(-)、(+)设为低表达，(++)、(+++)为高表达。检测结果应用χ2检验，Fisher精确概率法计算。见图9～12。I型胶原表达情况见表1、2。外用积雪苷软膏后，B组、C组、D组总胶原高表达的阳性率分别为70.83%、37.50%、33.33%，对照组A组总胶原高表达的阳性率为79.17%，实验组胶原高表达的阳性率明显降低，四组率比较，Fisher精确概率检验法计算(P=0.001)，差别具有统计学意义。再进行四组率的两两比较，应用Scheffé可信区间法，A组与B组比较，95%可信区间为(-0.2643～0.4311)，可信区间包含0，此两组间的差异无显著性；A组与C组比较，95%可信区间为(0.0562～0.7772)，可信区间不包含0，两组间差异具有统计学意义；A组与D组比较，95%可信区间为(0.1035～0.8133)，可信区间不包含0，两组间差异具有统计学意义；B组与C组比较，95%可信区间为(-0.0455～0.7121)，可信区间包含0，两组间差异无统计学意义；B组与D组比较，95%可信区间为(0.0015～0.7465)，可信区间不包含0，两组间差异有统计学意义；C组与D组比较，95%可信区间为(-0.3438～0.4272)，可信区间包含0，两组间差异无统计学意义。

表1 I型胶原蛋白阳性表达数列表

表2 I型胶原蛋白表达统计表

2.4 透射电镜观察 透射电镜观察显示：A组成纤维细胞数量仍多，细胞核膜清晰，核仁明显，有较丰富的细胞器，粗面内质网和线粒体中等，核糖体和高尔基器丰富，胶原丰富，排列紊乱。B、C、D组成纤维细胞明显减少，可见凋亡细胞，细胞核固缩，膜结构不清，有坏死的细胞碎片及裸核状态的成纤维细胞。粗面内质网扩张，呈囊泡状，线粒体空泡变，胶原纤维溶解，可见细胞内、细胞外凋亡小体的产生。此变化以C、D组较明显。见图13、14。

图7C组用药6 w后见成纤维细胞数明显减少，边缘胶原纤维排列整齐、疏松、趋于正常真皮结构(HE,×100)图8对照基质外用6 w后见成纤维细胞数较多，胶原纤维粗大、排列紊乱(HE,×100)图9A组，I型胶原表达(免疫组化,×100)

图10B组I型胶原表达(免疫组化，×100)

图11C组I型胶原表达(免疫组化,×100)图12D组I型胶原表达(免疫组化,×100)图13C组6 w后透射电镜下见成纤维细胞核固缩，膜结构不清，胶原纤维溶解(标尺为1 μm)图14A组6 w后透射电镜下见成纤维细胞内有丰富的粗面内质网、核糖体(标尺为1 μm)

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种临床上常见的纤维增生性疾病，是以皮肤受创伤后真皮异常纤维增生反应为特征的病理性组织。其形成机制尚未明了，近年来越来越多的学者倾向于认为瘢痕疙瘩是一种良性的皮肤肿瘤[4]，目前临床上一般主张应用综合疗法，多采用手术切除联合糖皮质激素注射、压力疗法、硅胶片敷贴、术后浅层放疗等进行综合治疗[5]。但上述疗法或存在一定的创伤性，或应用不便，或费用较高，而且不能完全抑制瘢痕疙瘩的复发。在此基础上，人们一直在寻找更为方便、安全、有效的治疗方法来辅助治疗，降低复发率。积雪苷能抑制成纤维母细胞增殖，降低转酰氨基酶活化，减少酸性黏多糖和胶原量，使结缔组织的基质和纤维成份的过度增生受到控制，对无秩序的瘢痕疙瘩增生具有抑制和缓解作用[6]；而且积雪苷通过抑制瘢痕的Smad通路使成纤维细胞增殖受阻改变成纤维细胞的超微结构 ,促进其凋亡[7]，积雪苷还可以通过降低TGF-β1达到促进一型胶原降解，减轻瘢痕增生的作用[8]。前期我们已经证实在体外细胞水平上积雪苷能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并下调CTGF的表达，且还与积雪苷作用浓度存在一定的依赖性，本实验从裸鼠瘢痕疙瘩模型中证实外用积雪苷软膏能减少瘢痕疙瘩成纤维细胞并下调I型胶原蛋白的表达,为临床用药提供理论基础。