荧光染色法和氢氧化钾湿片法在诊断浅部真菌感染中的敏感度比较

杨颜龙 张素敏 易松柏 周天玖 张 禁

氢氧化钾湿片法是门诊真菌镜检常用的方法。其对经验要求较高，视野对比度较差，易出现漏诊或误诊。近年荧光染色法渐用于真菌镜检领域，其机理是：真菌细胞壁上的几丁质，可与荧光染色剂里的荧光素产生特异性结合，在特定波段紫外光照射下，菌丝和孢子发出亮绿或亮蓝色的荧光，易于区分背景和杂质。本研究分别应用两种方法同视野下检测浅部真菌感染患者466例，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院皮肤科门诊2017年8月至2018年8月临床表现典型[1]的浅部真菌感染患者466例，其中手足癣181例、体股癣168例、花斑糠疹52例、甲癣40例、头癣25例；分别选择其易检出部位的皮屑、甲屑、断发发根作为检验标本。

1.2 入选标准 临床表现与病史符合浅部真菌感染且近期局部或系统未使用过抗真菌药物者。

1.3 研究方法 检验师先使用氢氧化钾湿片法，对患者进行取材、镜检至判定结果；再由同一皮损区取材，荧光染色法不开荧光灯、打开荧光灯镜检，分别判定结果并分别计时。再由护士使用两种方法来判定结果并分别计时。计时分取材制片和读取结果两段。由另一名检验师再次复核结果，若检验结果有争议，则重新制片观察。由一名医师负责本研究诊断、计时、拍照、统计任务。

1.4 取材及检测方法 皮损处均用75%乙醇消毒后取材。手足癣、体股癣、花斑糠疹均取皮屑，钝头刀刮取皮损炎性活动边缘鳞屑；甲癣取甲屑，先刮除表层的碎甲屑，再取接近正常甲组织的甲下碎屑；头癣取断发发根，镊子拔取病发。取材时，载玻片需要放置在水平位置上，将刮取的标本均匀置于载玻片中心。氢氧化钾湿片法滴上一滴氢氧化钾液，盖上盖玻片轻压排出气泡，使用酒精灯略微加热，再次轻压摊匀标本。用加装莱卡荧光显微镜图文分析系统的奥林巴斯 CX31显微镜观察。荧光染色法则滴上一滴真菌荧光染色液(苏宿械备20170027号)，覆盖整个样品，据标本不同，静置30 s～2 min不等，盖上玻片，然后轻压，挤出气泡，铺匀标本，完成制片。用同一台显微镜观察，先不开荧光，用10倍物镜寻找真菌视野，40倍物镜观察确认，确定是否有真菌菌丝或孢子结构存在，并拍照，过程同普通氢氧化钾湿片法。然后打开荧光，寻找菌丝、孢子。在有无荧光的同视野下拍照、存档。最后，分别统计出荧光染色法和氢氧化钾湿片法的阳性率，分析比较。

1.5 统计学方法 计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 同视野下氢氧化钾湿片法与荧光染色法直观比较 甲癣、手癣、头癣的检测中，两种方法差别明显。氢氧化钾湿片法的背景杂乱、孢子、菌丝不易辨认、阳性率低，需费时寻找阳性目标。特别是由护士来读取结果时，常会把阳性结果判断为阴性，而打开荧光后，菌丝、孢子显现清晰，可快速确认阳性目标。无论护士和检验师，所得结果基本一致。花斑糠疹、体股癣、足癣，阳性率均较高，两种方法差别不大，但荧光染色法的阳性率更高。从效果来看，单纯使用氢氧化钾制片和使用荧光液制片且不打开荧光灯，得到的效果是基本没有区别。各种浅部真菌病在同一标本、同视野下采用两种方法观察，显示荧光染色法阳性率高、敏感度高。见图1～6。黑色箭头所指为阳性目标(菌丝、孢子)、红色箭头所指为易干扰诊断的东西(杂质、重伪影、气泡等)。

图11a:体癣标本，菌丝与背景对比差，但可见到菌丝(×400)；1b:菌丝与背景对比良好，菌丝明显(×400)图22a:足癣标本，可见菌丝，有伪影(×400)；2b:菌丝明显，伪影消失(×400)图33a:甲癣标本，菌丝不易找到，可见气泡、杂质(×100)；3b:视野中心见明显菌丝，可见气泡、杂质(×100)图44a:花斑糠疹标本，可见大量短棒状菌丝，与背景对比度不高，未见到孢子；可见黑色杂质干扰判断(×400)；4b:可见大量明亮的短棒状菌丝，且可见圆形孢子，未见杂质(×400)图55a:头癣标本，可见毛根残缺，隐约可见孢子或者菌丝；右下方是否为孢子不易判断(×100)；5b:发根处明显链状孢子，右下方看到成堆的孢子(×100)图66a:头癣标本，为图5的局部(发根的右上部分)，亦可见到链状孢子；右侧可见杂质(×400)；6b:链状孢子显影良好，杂质显影不明显(×400)

2.2 氢氧化钾湿片法与荧光染色法阳性率比较 两种方法的总阳性率分别为91.42%和97.64%，有统计学差异(χ2=17.46，P<0.05)。见表1。

表1 两种方法在各种浅部真菌病镜检结果比较

3 讨论

氢氧化钾湿片法真菌镜检临床应用多年，目前仍有其应用价值[1]。但该方法用于甲屑坚硬、皮屑肥厚的甲癣、手癣、头癣时，常需加热，制片过程平均需3 min左右，影响效率[2]。荧光染色法真菌镜检，滴加荧光液1 min左右，无需加热即可开始读取结果。读取结果时，氢氧化钾湿片法视野内，背景与真菌菌丝、孢子的色泽和亮度差别不大，特别是操作人员经验不足时，常反复调整视野层面、来回多个视野寻找，才敢确认是否阳性。如检验师平均2 min内，可以确认阳性的标本，经验不足的护士，则需要5 min左右，其对操作人员的经验依赖性大。而荧光染色法，菌丝、孢子会显示出亮蓝的荧光，与视野背景对比度高，检验师、护士均能在1 min内确认结果是否阳性，工作效率较高。

在花斑糠疹、体癣、股癣、足癣检查时，因标本细薄，易于溶解，且菌丝、孢子形态易于辨认，检验师与护士所需时间差别不太明显，但制片过程仍是荧光染

色法的效率较高。两种方法都会因杂质、气泡等而干扰判断，尤其氢氧化钾湿片法，杂质、气泡、油脂滴常被误认为是菌丝、孢子，经验不足时，更易误判。在使用荧光后，真菌孢子、菌丝显示明亮的蓝色荧光，与背景微弱灰蓝色对比明显，可一目了然判断孢子、菌丝是否存在，提高真菌检查阳性率及准确率[3]。

本研究同视野下比较两种检查方法，与其他研究相比较，更能体现出荧光法的优势[4，5]。目前两种检测方法均有其临床使用价值，但荧光染色法操作更简便、敏感度高，检出结果快速、准确，值得临床应用。