miR-127-3p在肾癌中的表达及生物学意义*

2019-07-17王亚东刘尚文余绍龙温志鹏陈智锋林峰

广东医学 2019年12期

王亚东，刘尚文，余绍龙，温志鹏，陈智锋，林峰

深圳市中医院泌尿外科 (广东深圳 518033)

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)约占成人恶性肿瘤的3%，在过去二十余年其发病率有所增长[1]。肾癌的发病原因尚不明确，早期诊断缺乏有效的生物学标记物，且该种肿瘤对放化疗均不敏感，所有肾癌预后一般较差[2]。微小RNA(MiRNA)是19～23个核苷酸组成非编码RNA，其主要在转录后发挥调控作用，已知约一半的蛋白质编码基因受MiRNA调节。迄今为止，已鉴定出约2 000个人类MiRNA，这些MiRNA参与了包括增殖、凋亡、迁移和分化在内的生物过程的调节[3]。许多MiRNA已被证实作为肿瘤抑制因子或癌基因发挥作用，如miR-127-3p在人类乳腺癌中表达下调[4]。本研究试图检测肾癌组织中的miR-127-3p表达量，并运用肾癌细胞系探索miR-127-3p与肾癌生物学关系，为进一步明确肾癌的发病机制奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 标本收集与处理实验标本10对肾癌均来自于2016年8月至2018年8月在深圳市中医院行肾癌根治手术标本。本项目征得深圳市中医院伦理学委员会批准，且实验所需标本均征得患者本人及家属同意。切除标本在RNA保存液中保存，约24 h转入-80℃冰箱内保存。癌旁组织定义为癌组织周围>2 cm正常肾组织，所有病例术后病理均为肾透明细胞癌。

1.2 RNA提取及RT-PCR Trizol裂解组织标本，抽提总RNA，根据miScript SYBR Green PCR Kit试剂说明书，模板是反转录合成的cDNA，RT-PCR反应在LC480荧光定量PCR仪上进行。反应体系的总体积为10 μL，其中QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix有5 μL。miR-127-3p上游 5′-GAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG-3′，下游 5′-CCCAAGCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC-3′；U6：上游 5′-TCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCCT-3′。反应条件：95℃ 2 min，94℃ 10 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共进行40个循环。

1.3 细胞培养选取肾癌细胞系786-O和ACHN，细胞系培养基组成：90%DMEM培养基、10%胎牛血清、1%抗生素(100 μg/mL青霉素和100 mg/mL硫酸链霉素)和1%谷氨酸盐。培养条件：37℃的加湿培养箱(5%CO2)。

1.4 细胞转染依照说明书使用脂质体Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染ACHN和786-O细胞。试验分2组：阴性对照组和miR-127-3p mimics组。引物如下：miR-127-3p mimics 上游引物：5′-TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT-3′，下游引物： 5′-CCAAGCTCAGACGGATCCGATT-3′；阴性对照上游引物： 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3′，下游引物： 5′-ACGTGACACGTTCGGAGAATT-3′。

1.5 细胞增殖试验将786-O和ACHN细胞接种到96孔培养板中，培养板的细胞密度为6000个细胞/孔，每孔补足200 μL培养基。各试验组每组设5个复孔。在37℃下培养4 h，通过向每个孔中添加20μL MTT(5 mg/mL，Sigma，USA)来测定细胞生长。连续进行3 d增殖测定，每次测定间隔时间为24 h。测量490 nm波长下每个样品的光密度(OD)。

1.6 细胞迁移试验在每6孔培养皿中接种约500 000个细胞(786-O和ACHN)，24 h后使用Lipofectamine 2000注入miR-127-3p mimics(100 pmol)或阴性对照物(100 pmol)。转染6 h后，使用无菌200 μL移液管尖端和标记物在细胞单层中刮伤。刮伤后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)培养基清洗细胞3次，并在37℃孵育。在相同点上进行划痕后0和24 h，用数码相机系统获取划痕图像。MIAS-2000软件(Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany)用于确定迁移距离(μm)。

1.7 细胞凋亡试验运用流式细胞仪评价细胞凋亡程度。786-O和ACHN在37℃和5%的CO2条件下在6个孔板中培养，收集上述转染48 h后细胞，然后与预先冷冻的PBS洗涤两次，将洗涤细胞悬浮于Binding buffer缓冲液(invitrogen)中,加入碘化丙锭5 μL，去RNA酶1.25 μL，裂解液0.25 μL后检测细胞周期。流式细胞仪(美国佛罗里达州迈阿密贝克曼库尔特)对荧光进行分析，激发强度为488 nm。

2 结果

2.1 肾癌及癌旁组织标本miR-127-3p表达情况 10例肾癌组织标本中miR-127-3p的表达量为1.02±0.56，明显低于癌旁组织(1.71±0.81)，差异有统计学意义(t=6.57,P<0.01)。

2.2 miR-127-3p mimics抑制肾癌细胞增殖 786-O细胞在转染后24、48、72 h的增殖率分别下降了4.80%(P>0.05)、13.37%(P<0.05)、18.00%(P<0.05)，ACHN细胞的增殖率分别下降了3.50%(P>0.05)、12.36%(P<0.05)和16.00%(P<0.05)。这些结果表明，与阴性对照抑制剂相比，miR-127-3p mimics降低了786-O和ACHN细胞的生长。见表1。

表1 相比阴性对照，miR-127-3p mimics抑制786O 和ACHN细胞生长 %

△与阴性对照比较P<0.05

2.3 miR-127-3p mimics抑制肾癌细胞迁移采用划痕法观察miR-127-3p在细胞迁移中的作用。如图1所示，与阴性对照组相比，转染miR-127-3p组的细胞迁移明显受到抑制。786-O细胞的迁移抑制率为24.67%(P<0.05)，ACHN细胞的迁移抑制率为40.51%(P<0.05)，表明miR-127-3p mimics抑制了肾癌细胞的迁移。见图1。

2.4 miR-127-3p mimics诱导肾癌细胞凋亡用miR-127-3p mimics和阴性对照物转染786-O和ACHN细胞48 h，流式细胞术分析表明，用miR-127-3p mimics和阴性对照物转染786-O细胞的凋亡率分别为5.10%和2.50%(P<0.05)，而ACHN细胞的凋亡率分别为4.80%和1.50%(P<0.05)。这些数据表明，miR-127-3p mimics促进了肾癌细胞凋亡。见图2。

3 讨论

肿瘤发生与多种基因的序列性改变有关，包括癌基因的激活和抗癌基因的功能障碍[5]。大约50%以上的MiRNA基因位于与多种肿瘤相关基因区域或脆弱基因位点，这表明了MiRNA在肿瘤发展、增殖、凋亡及转移等方面均起着复杂作用[6-7]。一些MiRNA在肾细胞癌中表达明显上调，如miR-210、miR-155和miR-21，另一些MiRNA，如miR-708和miR-145则表达降低，这意味着它们不仅具有促癌作用，亦具有肿瘤抑制作用[8-9]。在先前的研究中，miR-127-3p已经证实在肾细胞癌组织中表达下调[5]。

多项研究显示：miR-127-3p在多种肿瘤组织中均有表达，如Zhang等[10]报道，通过调节靶蛋白SETD8，miR-127-3p抑制了骨肉瘤细胞株的增殖、迁移和侵袭。在人类胰腺癌及胰腺癌体外细胞株中， miR-127可能抑制下游靶基因BAG5，从而抑制胰腺癌的发生及发展[11]。在慢病毒感染的capan-1和panc-1细胞中，miR-127的过度表达显著抑制了肿瘤的进展、细胞周期转变、体外侵袭以及体内致瘤性[11]。然而，也有研究显示，miR-127起着致癌的作用，如Jing等[12]发现，通过靶向肿瘤抑制基因SETP7，miR-127-3p可促进胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭。由此可见miR-127-3p参与肿瘤发生及进展的调控。虽miR-127-3p参与多种肿瘤形成及进展，但国内外关于miR-127-3p在肾癌中的表达及生物学意义暂无相关研究，前期通过大规模平行测序技术成功地鉴定了肾细胞癌中许多异常的MiRNA表达，其中miR-127-3p表达明显下调[5]。且本次选取的10例癌组织及癌旁正常组织的RT-PCR结果符合预期结果。然而，miR-127-3p在肾细胞癌中的生物学作用尚未完全阐明，本次研究通过将miR-127-3p mimics和阴性对照物转染至肾癌786-O和ACHN细胞中，分析了miR-127-3p对肾癌细胞迁移、增殖和凋亡的作用。结果表明，miR-127-3p mimics转染的细胞迁移、增殖减少，细胞凋亡增加。研究结果对miR-127-3p在肾细胞癌发生、发展中的作用及可能机制提供了新的认识。然而，本研究也存在许多缺憾，如MiRNA的异常表达参与肿瘤发生及进展，归结为MiRNA异常导致靶基因异常表达，但miR-127-3p以往鉴定的靶基因是否在肾癌中适用，需要继续验证。另外，本研究仅选择肾癌两种细胞系，临床病例选择缺乏，制约的实验结果的可靠性，期待扩大临床样本量，回归临床研究初衷。