苦参碱对膀胱癌模型大鼠前列腺素脱氢酶、血管内皮生长因子以及细胞膜磷脂酶A2的影响*

王官峰， 陈如， 马锋， 罗居东

1三二〇一医院泌尿外科(陕西汉中 723000)； 2常州市第二人民医院肿瘤科(江苏常州 213000)

膀胱癌属于泌尿生殖系统肿瘤，在临床上较为常见，其发病位置位于膀胱黏膜，临床上常见的类型多样[1]。膀胱癌常发病的人群是中老年人群，男性患病人数显著高于女性，近年来研究数据显示，膀胱癌患病人数在逐年上升，严重影响人们的生活质量[2]。膀胱癌患者的临床表现主要有：血尿，出现膀胱刺激征，且伴有间歇性，但是具有无痛性。临床上治疗膀胱癌主要采取手术、放化疗、免疫治疗等手段，膀胱癌如果做到早期及时治疗，可以有效降低患者的病死率。膀胱癌的病因复杂，既有遗传因素又有环境因素的影响。多数患者病因一般是因为经常与苯胺、二氨基联苯和芳香胺类化学物质密切接触有关[3-4]。2017年4月至2018年5月，本研究通过建立膀胱癌大鼠模型，采用含有苦参碱的药物对其进行治疗，探讨苦参碱对膀胱癌大鼠前列腺素脱氢酶(prostaglandin dehydrogenase，PGDH)、血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)以及细胞膜磷脂酶A2(cytosolic phospholipasesA2，cPLA2)表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 研究动物 选择SD健康雌性大鼠60只，由广西医科大学实验动物中心提供。其年龄6～10周龄，平均(8.1±0.5)周龄，体重20～27 g,平均(24.4±2.6)g，饲养温度22～25℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一喂给标准饲料，允许它们自由活动，饲养时间为1周。本研究所做实验均获得我院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 苦参碱购自天根生化科技有限公司；N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝基胺(BBN)购自Invitrogen公司；塞来昔布购自Dako公司；甲醛溶液中性固定液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；磷酸缓冲盐溶液购自上海国药集团化学试剂有限公司；苏木素伊红购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Gibco公司；小鼠抗大鼠环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、cPLA2及PGDH抗体购自Sigma公司；兔抗人COX-2、cPLA2及PGDH购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 建模及分组处理 将60只大鼠采用随机数字表法分为模型组、实验组和空白组，每组各20只。模型组、实验组两组大鼠采取灌胃的形式服用致癌剂BBN，剂量200 mg/mL，给药时间是下午16～18点，连续灌胃8周。实验组大鼠给予苦参碱灌胃治疗，空白组和实验组两组大鼠给予等体积的生理盐水，灌胃，1 d/次，用药时间上午7～9点，连续治疗35周。

1.3.2 膀胱组织的处理 膀胱癌大鼠在35周进行称重后处死，后将膀胱完整取出后，使用4%多聚甲醛固定进行解剖。经过石蜡包埋，使用HE染色。

1.3.3 双抗体夹心法检测cPLA2、VEGF、PGDH表达水平 将待测血清采用双抗体夹心法对3组大鼠的cPLA2、VEGF、PGDH进行检测，将待测血清吸附在微量滴板的小孔里进行洗涤，加入待测抗原，如果两者是特异的，则会产生结合反应，把多出来的抗体洗除，然后加入与待测抗原中呈现出特异反应的酶联抗体，使其形成“夹心”现象，接着加入该酶的底物，如果能看到有色的酶解产物产生，则说明在孔壁上存在着相对应的抗原，从而通过显色后读取浓度的具体数据来计算出cPLA2、VEGF、PGDH的表达水平。

1.3.4 TUNEL法检测膀胱癌细胞凋亡 将采集的标本细胞传代到6孔板中，置于温度为37℃，浓度为5%的二氧化碳的饱和湿度环境下培养24 h，加入浓度为0.25%的胰蛋白酶进行消化，用离心机以2 000 r/min的转速离心5 min后收取细胞，然后使用PBS缓冲液洗涤3 min，重复洗涤2次，再次用离心机以 2 000 r/min的转速分离后收集细胞，加入1 mL PI染液，在避光的常温环境中放置1 h后，然后用特异荧光标记后，在鞘液包裹下高速流动中，流动期间会发射出光子，严格按照流式细胞仪检测，利用发光信号测量仪检测光子数值，检测细胞凋亡情况。

1.3.5 Western blot检测p16INK4a抑制CyclinD1及CDK4表达水平 使用PBS缓冲液将采集到的细胞清洗3遍以上，分离缓冲液，再加入IP细胞裂解液，进行裂解35 min，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，通过10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100 V,电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释按(1∶1 000)稀释一抗Tubulin(内参照)，在4℃的环境下孵育过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液清洗反复清洗。最后加入显影剂将其仅在底物溶液中进行显色，严格按照显影定影试剂盒操作说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件，肿瘤发生率采用2检验或Fisher确切概率法比较。计量资料采用描述，组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠病理组织学观察 空白组大鼠膀胱细胞结构完整，细胞黏膜之间表现光滑，平整，细胞间质之间并未发现炎性细胞的浸润；模型组大鼠膀胱癌细胞纤细、出现较多的分支，细胞排列杂乱，体积差异很大，异型性明显；实验组大鼠膀胱癌细胞间质之间出现水肿、伴有大量的充血、发现有淋巴细胞的浸润，部分癌细胞开始侵犯黏膜固有层以及肌层。见图1。

A：空白组；B：模型组；C：实验组

2.2 3组大鼠cPLA2、VEGF、PGDH相对蛋白表达量比较 空白组和实验组PGDH表达水平显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组VEGF水平显著高于实验组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组cPLA2水平显著高于实验组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

项目nPGDHVEGFcPLA2空白组201.00±0.011.00±0.011.00±0.01模型组200.28±0.042.05±0.131.95±0.12实验组200.91±0.031.08±0.051.10±0.05F值117.1454.0252.92P值<0.05<0.05<0.05

2.3 3组大鼠肿瘤细胞凋亡指数比较 空白组大鼠肿瘤细胞凋亡指数明显低于实验组和模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，实验组大鼠肿瘤细胞凋亡指数高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠肿瘤细胞增殖指数高于实验组和空白组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

项目n肿瘤细胞凋亡指数肿瘤细胞增殖指数空白组203.46±0.433.35±0.45模型组2010.75±1.4317.86±3.12实验组2016.53±2.2510.33±1.29F值12.0342.42P值<0.05<0.05

2.4 3组大鼠p16INK4a、CyclinD1、CDK4蛋白的表达比较 实验组大鼠通过p16INK4a蛋白表达上调，从而抑制了CyclinD1及CDK4表达，p16INK4a表达下降，CyclinD1及CDK4的表达则升高。3组实验数据比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

项目np16INK4aCyclinD1CDK4空白组200.58±0.200.20±0.140.17±0.16模型组200.30±0.180.63±0.220.91±0.31实验组200.45±0.200.39±0.240.65±0.37F值6.8911.0614.23P值<0.05<0.05<0.05

3 讨论

临床上手术治疗膀胱癌广泛采取内镜和膀胱内治疗，并且成效显著，但出现复发的膀胱癌患者仍有50%～70%，其中进展到浸润期的患者占10%～30%，造成患者死亡的主要原因便是浸润性膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌恶性程度高，进展快，易转移和复发，预后比较差，5年生存率仅约25%[5-6]。

苦参碱属于四环喹嗪啶类化合物的天然生物碱，主要是从苦参中提炼出来。苦参碱临床上常用来治疗肿瘤疾病，主要具有抗炎、镇痛作用，同时可以抵抗病毒，促进免疫调节，避免心率失常和感染发生[7]。研究显示[8-9]，苦参碱对膀胱癌EJ细胞的生长和发育起到干扰作用，其作用机制是：通过下调Bcl-2蛋白表达，促进EJ细胞凋亡；经过不同浓度的苦参碱干扰膀胱癌BIU-87细胞，发现苦参碱对其细胞周期有阻滞作用，最终导致细胞凋亡[10]。苦参碱影响膀胱癌体外实验研究较多，但是相关的体内研究实验少，本研究主要通过建立膀胱癌大鼠模型，研究苦参碱治疗膀胱癌的效果及相关作用机制。本研究应用的致癌试剂是BBN，优势是BBN可以口服，具有较强的特异性和较高的致癌率[11]。

在前列腺素生成、降解的过程之中，cPLA2、PGDH发挥着较为关键的作用[12]。前列腺素主要是由花生四烯酸(AA)转化形成产生的，而AA主要是由cPLA2催化细胞分泌产生，从而参与前列腺素的产生以及疾病发展过程。有学者通过研究表明，cPLA2与多种恶性肿瘤的发生、发展有着密切关系，包括前列腺癌、膀胱癌等[13-14]。在前列腺素生成以后，PGDH可以将其氧化降解，使它原有的生物活性大幅度降低，大量的研究表明，PGDH是一种重要的抑癌基因，在大部分肿瘤组织中呈现异常低表达甚至不表达。本研究结果显示，模型组大鼠cPLA2水平较高，PGDH水平较低，说明苦参碱能够抑制前列腺素的生成，降低其生物活性，从而抑制肿瘤组织的发展，对cPLA2、PGDH水平进行调控。

VEGF可以促进血管的生长和发育，还可以通过调控病理性血管发生和增加血管通透性而起作用，在膀胱癌、胰腺癌、直肠癌等各类肿瘤组织中，均有高水平的VEGF表达。VEGF能够参与肿瘤营养血管的发生和构建,刺激血管内皮细胞增殖,促进血管内的物质外渗,可以为肿瘤的生长和发育、浸润和迁移提供适宜的环境条件[16]。

模型组PGDH相对蛋白表达量显著低于实验组和空白组，模型组VEGF相对蛋白表达量显著高于实验组和空白组，模型组cPLA2相对蛋白表达量显著高于实验组和空白组；空白组大鼠肿瘤细胞凋亡指数明显低于实验组和模型组，实验组大鼠肿瘤细胞凋亡指数高于模型组；肿瘤细胞增殖指数模型组大鼠高于实验组和空白组大鼠，实验组大鼠p16INK4a蛋白表达水平明显高于实验组和模型组。

p16INK4a是一种抑癌基因，膀胱癌的发生、发展与其有着重要关系，p16INK4a可以抑制CyclinD1/CDK4复合物的发挥[17-18]。p16INK4a是重要的调节因子，其通过与CyclinD1结合，对CyclinD1和CDK4结合有抑制作用，阻止CyclinD1-CDK4相关复合物的生成，对刺激酶有抑制效果，Rb蛋白不能进行磷酸化，其与转录因子E2F结合可以有效抑制Rb蛋白的活性，达到抑制细胞增殖的效果[19]。p16INK4a/CyclinD1/CDK4是细胞周期中重要的调控通路，在调控G1/S检测点起到关键性的转导调控作用。研究数据显示，p16INK4a蛋白水平下调，以及linD1和CDK4蛋白出现过表达，和p16INK4a/CyclinD1/CDK4通路有紧密联系，影响膀胱癌的分级导致其复发[20]。本研究显示，膀胱癌大鼠p16INK4a表达下降，CyclinD1和CDK4的表达升高，经过苦参碱干预，膀胱癌大鼠p16INK4a表达上升，CyclinD1和CDK4的表达下降。说明苦参碱对p16INK4a、CyclinD1和CDK4蛋白有显著的抑制作用。分析原因：苦参碱通过激活p16INK4a/CyclinD1/CDK4通路，调控细胞周期，对p16INK4a表达起抑制作用是为了破坏介导效果，从而抑制膀胱癌细胞的增殖，促进其细胞凋亡。

综上所述，苦参碱具有能够使膀胱癌大鼠cPLA2降低，PGDH相对蛋白表达量提高的作用，还可以提高肿瘤细胞凋亡指数，降低肿瘤细胞增殖指数。本次实验为临床中膀胱癌的治疗和预后提供重要的理论依据。