氧化应激在大鼠自身免疫性肺气肿中的作用*

李佳艺， 张野， 张程

1贵州医科大学临床医学院(贵州贵阳 550004)； 2铜仁市第一人民医院呼吸内科(贵州铜仁 554300)； 3国家卫生健康委员会肺脏免疫性疾病重点实验室、贵州省人民医院呼吸与危重症医学科(贵州贵阳 550002)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是临床上很常见的气道疾病，主要包括慢性支气管炎和肺气肿两种病理变化[1]。目前国内外专家认为该病发病和自身免疫反应[2-3]、氧化应激[4]等有关，但后者在自身免疫性肺气肿中的作用如何？目前还不清楚。鉴于氧化应激和吸烟肺气肿关系密切，所以，我们以大鼠为研究对象，2017年5月至2018年2月通过复制自身免疫性肺气肿模型，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)浓度和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力，以及BALF和血清中抗内皮细胞抗体(AECA)的浓度，肺组织病理形态学改变等情况，旨在探讨氧化应激在自身免疫性肺气肿中的作用，为临床上COPD的治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级SD雄性大鼠共20只，鼠龄10周，体重190～230 g。由重庆市腾鑫科技公司有偿提供[许可证号：SCXK-(军)2012-0011，NO：0052464]。实验室按正常昼夜节律，室温约25℃，腾鑫科技公司提供无菌全营养饲料，饮水为饮用水。采用随机平均分配的原则，将大鼠分为健康对照组和自身免疫性肺气肿组，每组各10只。

1.2 药品和试剂 脐带首先由医院伦理委员会备案，并由产妇和家庭成员同意，取自贵州省人民医院产科产妇足月分娩后的脐带。GSH、SOD、GSH-Px、MDA及AECA测试盒为南京建成生物工程研究所供应。

1.3 实验方法

1.3.1 人脐静脉内皮细胞的培养 我们参照路苹[5]提取细胞方式并加以改进用来提取人脐静脉原代细胞，并进行培养、传代及鉴定。

1.3.2 模型建立及干预 根据相关文献[5-6]建立自身免疫性肺气肿模型：4～6代人脐静脉内皮细胞加入0.25% 胰酶进行消化，将所有细胞约1×107个重悬至1 mL后加入完全弗氏佐剂 1 mL 制备成乳状液，予10只自身免疫性肺气肿组大鼠腹腔注射。健康对照组10只大鼠予完全弗氏佐剂1 mL腹腔注射。在室温20～25℃动物房中饲养。

1.3.3 制备BALF及血清 参照文献[7-9]，21 d时麻醉大鼠，心尖搏动处采血离心分装，同时制作BALF分装，-80℃冻存。

1.3.4 测氧化应激相关指标及AECA 按试剂盒中说明书要求测BALF中MDA浓度、SOD活力、GSH-Px活力、GSH浓度，BALF及血清中AECA浓度。

1.3.5 制作肺组织病理标本和评估肺气肿 参照相关文献[9]，制作大鼠右肺组织病理切片并进行HE染色，计算平均内衬间隔(MLI)及平均肺泡数(MAN)。病理组织切片均采用双盲法读片。

2 结果

2.1 大鼠肺组织的病理改变 健康对照组气管壁的构架清楚，肺泡间隔完整，肺组织构造正常(图1)。自身免疫性肺气肿组肺组织切片可见部分区域肺泡扩张，部分肺泡间隔变窄，肺泡间隔断裂致使相邻肺泡融合成较大的囊腔，这与肺气肿显微镜下的变化一致(图2)。

图1 健康对照组肺组织(HE，×400)

图2 自身免疫性肺气肿组肺组织(HE，×400)

2.2 两组大鼠MLI及MAN比较 自身免疫性肺气肿组MLI较健康对照组增加，MAN较健康对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

项目n MLI(×10-6 m/个)MAN(×106个/m2)健康对照组1091.12±4.64231.78±17.56自身免疫性肺气肿组10266.73±27.20∗74.43±11.85∗P值<0.05<0.05

*与健康对照组比较P<0.05

2.3 氧化应激相关指标及AECA的比较 BALF中自身免疫性肺气肿组GSH浓度、GSH-Px、SOD活力较健康对照组降低，MDA浓度较健康对照组升高，BALF及血清中自身免疫性肺气肿组AECA浓度较健康对照组升高，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

项目例数GSH(μmol/L)MDA(nmol/mL)GSH-Px活力SOD活力血清AECA(ng/mL)BALF中AECA(ng/mL)健康对照组10331.54±31.890.28±0.0342.12±5.5038.34±3.8059.97±3.6454.86±2.63自身免疫性肺气肿组10182.26±31.61∗1.81±0.06∗18.45±4.50∗16.18±2.19∗90.64±6.72∗86.69±3.36∗P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

*与健康对照组比较P<0.05

3 讨论

AECA是对血管内皮细胞有特异性的抗体[10]，可以诱导损伤血管内皮细胞，在多种自身免疫疾病中均可检测出[11-14]，故学者提出AECA可能参与了自身免疫性疾病的发生[15-16]。近年来，有越来越多的文献表明，在COPD患者的血中均检测出AECA[17-19]，并且AECA在血液中的浓度与COPD的严重程度呈正相关[20]。此外，国外学者研究发现[6]，自身免疫性肺气肿的动物模型中可以检出AECA，提示AECA可能参与自身免疫性肺气肿的形成[1,21]。

我们通过向大鼠腹腔内注射人脐静脉内皮细胞，旨在建立自身免疫性肺气肿模型。结果显示：自身免疫性肺气肿组血清及BALF中AECA的含量较健康对照组升高，同时病理改变显示自身免疫性肺气肿组肺泡部分扩张，部分肺泡隔狭窄，肺泡隔断开导致相邻肺泡融合成较大囊腔。通过测定 MLI及MAN的值，发现自身免疫性肺气肿组 MLI较健康对照组增加，MAN较健康对照组减少，说明此次成功地建立了自身免疫性肺气肿模型。

氧化应激对机体组织、细胞等产生的损伤是因为产生的多种自由基过量，从而使机体清除氧化物的负荷过重致使氧化体系和抗氧化体系失衡[22-23]。其中氧化系统中包含有MDA，抗氧化系统中包含有GSH、SOD、GSH-Px[24]。有文献报道[25]，吸烟诱导形成的肺气肿小鼠模型，其SOD活性及MDA均较正常组升高，考虑SOD活性增强与肺气肿形成后机体代偿相关，但不能完全清除自由基，机体氧化、抗氧化体系出现失衡，发生氧化应激产生过多MDA。

既然氧化应激与吸烟肺气肿有相关性，那么氧化应激是否与自身免疫性肺气肿也有关联呢？本次实验中通过对GSH、MDA、SOD、GSH-Px的检测，了解氧化应激与自身免疫性肺气肿的关系。通过实验数据发现自身免疫性肺气肿组BALF中的MDA浓度高于健康对照组，GSH浓度、SOD及GSH-Px活力较健康对照组降低。由以上数据我们可以得出，自身免疫性肺气肿组BALF中的MDA浓度升高，GSH浓度及SOD、GSH-Px活力降低提示此时大鼠体内氧化程度升高，存在氧化应激反应，上述指标均参与大鼠自身免疫性肺气肿的形成，从而提示氧化应激对自身免疫性肺气肿的形成有重要作用。