阿霉素诱导低龄大鼠心脏衰竭模型的研究

王思源，陈伟丹，陈欣欣

(广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心心脏中心，广东 广州 510623)

心血管疾病的动物模型对其病理生理机制的研究和新疗法的试验具有至关重要的意义[1]。心脏衰竭是许多心脏疾病发展的终末状态，模拟成年人心脏衰竭的动物模型研究的很多，包括容量和压力过载、心肌梗死、快速起搏和药物诱发的心肌疾病[2]。然而，很少有模拟幼儿及儿童的心脏衰竭动物模型的研究，但是由于幼儿和儿童的病理生理与成人存在显著差异[3]，且许多心脏疾病在幼儿和儿童期也会发生，如心肌炎和扩张型心肌病等，并最终导致严重心脏衰竭[4]。因此低龄动物心脏衰竭模型的建立就显得尤为重要。阿霉素容易获得，价格低廉，操作简单，是一种建立心脏衰竭模型的较好方法[2]。本研究旨在探讨腹腔注射阿霉素建立低龄大鼠心脏衰竭模型的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1主要药品与试剂 生理盐水；阿霉素(宜昌市永诺药业有限公司)；Elisa试剂盒(武汉华美生物科技有限公司)；戊巴比妥钠；乙醇；多聚甲醛；二甲苯；中性树脂；苏木精染液；丽春红；苯胺蓝。

1.1.2实验动物与分组 4周龄雄性SD大鼠22只，体质量100～150 g，由广东省医学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(粤)2013-0002)。动物实验获得广州医科大学实验动物伦理委员会的批准(伦理批准号：G2017-080)，遵照广州医科大学动物福利伦理相关规定进行。按照随机数字表分成对照组和模型组，每周分别腹腔注射生理盐水和阿霉素3 mg/kg，连续4周，再观察4周。

1.2 实验方法

1.2.1超声心动图检测 在异氟烷麻醉下，胸部备皮，用专用探头对其行经胸超声心动图检查(Vevo2100动物彩超仪，美国)，测量以下指标：左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短率(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、 左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期容量(LVEDV)、左心室收缩末期容量(LVESV)。

1.2.2ELISA检测 第八周时，每只大鼠经尾静脉采全血约2 mL，3000 g，离心15 min后取上清液，检测两组大鼠血清NT-BNP 和 CTNT值，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.2.3HE和Masson染色 第八周时，采用戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠，取出心脏用PBS洗去血液，4%多聚甲醛固定24 h，PBS洗涤3次后用70%、80%、90%和100%浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。包埋的心脏组织切片后进行HE 和Masson 染色，并通过徕卡DMi8倒置显微镜(德国)进行观察和拍照。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 大鼠体质量、心脏体质量质量比和生存率

与对照组比较，随着周龄的增加，模型组大鼠体质量增加较少，说明阿霉素影响了低龄大鼠的生长发育(图1A)。第八周时取出两组大鼠的心脏称重并计算心脏重量质量比，结果显示两组大鼠心脏重量质量比差异无统计学意义(图1B)，说明阿霉素不是通过心脏肥大导致心脏功能衰竭。模型组大鼠阿霉素腹腔注射4后，部分开始出现精神萎靡，腹水，脱毛等现象，第7周开始出现死亡，第八周时，对照组和模型组的生存率分别是100% 和63.64%(图1C)。

6004002000体重(g)对照组模型组012345678时间(周)ns0.40.30.20.10心脏体重比(%)对照组模型组对照组模型组012345678时间(周)100806040200生存率(%)ABC

A.两组大鼠体质量变化;B.第8周时两组大鼠的心脏重量质量比，P>0.05;C.两组大鼠生存率曲线

图1 两组大鼠的体质量、心脏体质量质量比和生存率

2.2 大鼠心脏功能变化情况

两组大鼠在模型诱导前，腹腔注射4周后、再观察的第7周和第8周分别行超声心动图检查，与对照组比较，模型组大鼠心脏功能在阿霉素诱导4周后，处于代偿状态，左心室射血分数和缩短率增加，观察的第7周和八周时，心脏功能出现恶化达到心脏衰竭状态(图2A)，图2B为第八周时两组大鼠的心脏超声心动图的长轴代表图。

2.3 血清NT-BNP 和 CTNT值

第八周时检测两组大鼠的血清NT-BNP 和CTNT 值，如图3A所示，与对照组比较，模型组大鼠血清NT-BNP明显升高(P<0.05)，说明阿霉素引起了低龄大鼠的心功能恶化。但两组大鼠血清CTNT值的差异无统计学意义(P>0.05)，说明阿霉素引起的低龄大鼠心脏衰竭过程是缓慢发生的，而非急性诱导(图3B)。

2.4 HE染色结果

心脏组织切片HE染色结果显示，对照组大鼠心肌纤维排列整齐、心肌细胞大小、形态正常；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、胞质呈溶解状态、空泡细胞增多、核深染，可见心肌纤维溶解断裂和少数淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润(图3)。

对照组模型组对照组模型组10090807060508060402001098765464205004003002001000150100500LVEF(%)LVEDD(mm)LVEDV(μL)LVESV(μL)LVESD(mm)LVFS(%)04780478时间(周)时间(周)模型组对照组BA

A.两组大鼠心脏功能参数随时间变化曲线;B.第8周时两组大鼠超声心动图的长轴代表图

注：LVEF(左心室射血分数)，LVFS(左心室缩短率)，LVEDD(左心室舒张末期内径)，LVESD(左心室收缩末期内径)，LVEDV(左心室舒张末期容量)，LVESV(左心室收缩末期容量)。

图2 两组大鼠心脏功能变化曲线图

A.第8周时两组大鼠血清的NT-BNP 值，*P<0.001;B.第8周时两组大鼠血清的CTNT值

图3 两组大鼠血清 NT-BNP和CTNT值

2.5 Masson染色结果

与对照组比较，模型组大鼠心脏组织切片Masson染色可见纤维化面积明显增多，说明阿霉素诱导的低龄大鼠心脏衰竭可能引起大鼠心脏的炎症反应进一步引起纤维化，导致心脏功能恶化。图5A为两组大鼠心脏组织切片的整个横切面扫描图，图5B为两组大鼠心脏组织切片Masson 染色的典型代表图。

对照组模型组

图4 第8周时两组大鼠心脏切片的HE染色结果(×400) 标尺=50 μm

A.第8周时两组大鼠的心脏组织切片Masson染色后整个心脏横切面扫描图(×50);B.第8周时两组大鼠心脏组织切片Masson染色典型代表图(×400)标尺=50 μm

图5 两组大鼠心脏组织Masson染色

3 讨 论

阿霉素是一种广泛用于治疗多种恶性肿瘤的蒽环类抗肿瘤药物，是诱导扩张型心肌病[5]和心力衰竭实验模型最常用的方法之一[6]。理想情况下，慢性心力衰竭动物模型应模仿人类心脏衰竭疾病的病理生理状态，它应包括心肌组织病理改变和左心室收缩功能受损的心脏重塑。目前在成年动物的模型中，

主要有短期模型和长期模型两种，短期模型是2周时间内注射总量约15 mg的阿霉素，长期模型是在5～8周内注射总量相等的阿霉素[7]。研究结果表明，与短期模型比较，长期模型能有效的产生与扩张型心肌病和心脏衰竭一致的心脏功能和结构的变化[8]。还有研究结果显示，迟发性心脏毒性通常发生在阿霉素使用后期，或发生在阿霉素使用终止后的2～3个月，且对于同一累积使用剂量，年龄越小者出现心脏毒性倾向越大，尤其是儿童更易受到阿霉素诱导的心肌损害[9]。在本研究中，我们通过给4周龄的雄性SD大鼠每周一次腹腔注射阿霉素，连续4周，总剂量12 mg的方法来建立低龄大鼠的心脏衰竭模型。结果显示，与对照组比较，第八周时模型组大鼠左心室射血分数和缩短率明显降低，血清NT-BNP也进一步证实心脏处于心脏衰竭状态。与对照组相比，模型组的心肌损伤明显，心肌细胞排列紊乱、空泡样变性明显，少数淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润和纤维化面积增加。

综上所述，本研究在成年动物长期模型的方法上降低了阿霉素诱导低龄大鼠的总剂量和注射次数，延长了观察时间，最终得到了理想的低龄大鼠心脏衰竭模型，其存活率为63.64%，为未来幼儿和儿童心力衰竭的研究者提供了一个心脏衰竭动物模型建立的参考。