DLLME-UPLC-TOF-MS法测定新鲜果汁中5种氨基甲酸酯类农药

叶玲，区硕俊，，*，岑建斌，李秀英，梁俊发，曾广丰

（1.广州检验检测认证集团有限公司，国家加工食品质量监督检验中心，广东 广州 511447；2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东 广州 510623）

氨基甲酸酯类化合物是一类有机合成的中间体，可进行酯交换、加成、缩合等反应，在医药、农药、织物整理和树脂改性等领域，具有较广阔的应用[1]。而氨基甲酸酯类农药由于其高效，分解快，选择性强等优点，在我国农业行业中有非常广泛的应用[2]。氨基甲酸酯类农药对作物还具有刺激生长的作用[3]，但氨基甲酸酯同样存在毒性大，对环境污染等问题，同时也可导致免疫系统及相关的疾病，例如过敏反应，自身免疫疾病和癌症[4-5]。随着消费者对食品质量安全意识水平的提高，食品中农药残留的相关问题也得到了重视。

对于氨基甲酸酯类农药的检测方法主要是液相色谱-串联质谱法[6-8]和气相色谱质谱法[9-11]。而高效液相色谱法[12-14]，由于检出限较低，需要对样品进行衍生，操作繁琐，重复性差。高分辨飞行时间质谱法具有准确定性的优点，在分析过程中能有效地排除杂质的。目前，氨基甲酸酯类农药的高分辨飞行时间质谱法[15-16]相关报道较少，本试验基于分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME） 技术，建立了同时新鲜果汁中5 种氨基甲酸酯类农药的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（ultra performance liquid chromatography-high resolution quadrupole time of flight mass spectrometer，UPLC -Q -TOF -MS）。 在DLLME 前处理下，目标物在短时间内完成提取，且富集倍数高，结合UPLC-TOF-MS 精确测定分子量对化合物进行定性定量分析。方法整体高效快速，准确性高，为氨基甲酸酯类农药的分析测定研究提供了参考方法。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

1.2 材料与试剂

新鲜水果：广州市售；5 种氨基甲酸酯标准品：异丙威、甲萘威、克百威、丁硫克百威、抗蚜威（纯度大于98%）：上海安谱公司；甲醇、甲酸、乙腈、正丙醇、乙醇、丙酮、异丙醇（色谱纯）：美国Thermo Fisher 公司；1-溴-3-甲基-丁烷、1-溴辛烷、溴环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷（均为分析纯）：上海安谱公司；氯化钠：广州试剂厂；中性氧化铝（Al-N）、硅胶键合十八烷基（C18）、氨丙基粉（NH2）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）：美国 Agilent 公司；Milli-Q 超纯水装置：美国Millipore 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

标准溶液：分别准确称取5 种氨基甲酸酯标准品各0.100 0 g 于100 mL 棕色具塞容量瓶中，用乙腈定容配制成1 000 mg/L 储备液。再用乙腈配制成个单标浓度为 2.0、10.0、20.0、50.0、100、200 μg/L。

1.3.2 样品前处理

样品先过滤备用，准确称取5 g 样品于50 mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，加入2 g N-丙基乙二胺（PSA）粉末，涡旋震荡 10 min，于 10 000 r/min 离心 5 min，转移上清液于15 mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，加入3 mL去离子水，0.1 g 氯化钠，0.2 mL 三氯甲烷，0.1 mL 甲醇，涡旋震荡5 min，于4 000 r/min 离心10 min，取下层提取液用乙腈定容至0.2 mL，供UPLC-Q-TOF-MS 测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：poroshell-120 EC-C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；进样体积：2 μL；流速 0.5 mL/min；柱温：40 ℃；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；梯度洗脱程序：0.0 min～10 min，90%～10%B；10 min～14 min，0%B；14 min～16 min，0 % B；16 min～17 min，90 % B，20 min stop。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾 离子源（electron sprayionization，ESI）和大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）复合源；APCI 源：连接 AB sciex 公司自动校正系统（CDS），每10 个样品自动校正一次，校正液流速0.35 mL/min；气帘气：40 psi，离子源雾化气：50 psi，离子源加热辅助气：50 psi，离子源温度：550 ℃，离子源电压5 500 V。一级TOF-MS 扫描准确质量范围：100 Da～1 000Da；数据采集时间：100 ms，DP：80 V，CE：10 V；二级 IDA-MS 扫描准确质量范围：50 Da～1 000 Da，DP：90 V，CE：25±10 V；高灵敏模式；数据采集时间：50 ms；信号阈值：100 cps；IDA 实验每循环采集6 次数据，动态背景减法扣除。

1.4 数据处理

所有质谱数据在ABSciex 公司的Analyst TF 1.6软件采集，数据在 PeakView 2.0，MasterView 2.0 和MultiQuant 3.0 等软件上定性定量处理分析。根据TOF-MS 和IDA-MS 高分辨质谱获得化合物的准确分子量，定性定量分析果汁中5 种氨基甲酸酯类农药。

2 结果与分析

2.1 定性定量分析依据

采用UPLC-Q-TOF-MS 液相色谱高分辨质谱方法检测分析5 种氨基甲酸酯，以目标物一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数和色谱保留时间等信息为定性分析依据，响应强度为定量依据；5 个目标化合物的定性定量分析质谱数据依据见表1，二级精确分子量质谱图见图1。

2.2 净化剂的选择

由于新鲜的果汁中含有大量的糖和色素，如果在不净化的情况下进行萃取，会导致萃取剂析出量少，加入有机溶剂后，沉淀物也会影响萃取剂的回收，使整体回收率偏低。试验比较了Al-N、C18、NH2、GCB、PSA5 种净化剂的净化效果。详细结果如图2。

表1 5 种农药化合物高分辨质谱数据Table 1 Mass fragmentation of five carbamate pesticides analyzed by IDA-MS

图1 5 种氨基甲酸酯的二级精确分子量质谱图Fig.1 Second level precise molecular spectra of five carbamate pesticides

图2 不同净化剂净化效果比较Fig.2 Comparison of purification effects of different purifying agents

其中PSA 的净化效果最好，净化后的样品颜色相对较浅，也较为澄清，使用2 g PSA 净化，各目标物回收率均在85.0%以上，故选取PSA 作为净化剂。

2.3 萃取剂及分散剂的选择

试验分别选取二氯甲烷、1-溴-3-甲基-丁烷、1-溴辛烷、溴环己烷、三氯甲烷5 种有机溶剂作为萃取溶剂。考察的5 种溶剂提取效果见图3。

图3 不同萃取剂提取效果Fig.3 Extraction effect of different extractants

结果表明，三氯甲烷的提取效率最高。所以，选择三氯甲烷作为萃取剂做进一步研究。分别考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正丙醇和异丙醇作为分散剂对萃取效果的影响。测定结果表明，选取甲醇为分散剂时的萃取效率最高。

2.4 萃取剂体积选择

试验前期考察了提取时间对萃取剂回收体积的影响，详细结果如图4。

图4 萃取剂体积对回收率的影响Fig.4 Effect of extractant volume on recovery

结果表明，振荡时间越长，离心后下层萃取剂越难析出。在提取时间为5 min 时，三氯甲烷较易析出，且5 种目标物的回收率也较高。本试验分别用50、150、200、250、300 μL 的三氯甲烷进行萃取，考察了萃取剂体积对萃取回收率的影响。随着三氯甲烷体积增大，回收率也增大，而当三氯甲烷体积大于200 μL 时，回收率增大已不明显，所以三氯甲烷200 μL 是最佳萃取体积。

2.5 溶液离子强度的优化

在样品中加入盐，增加整体的离子强度有利于低极性化合物在有机相中溶解，同时，使有机相更容易与水相分离。分别加入 50、100、150、200、250 mg NaCl，以5 种氨基甲酸酯的回收率为考察依据，详细结果如图5。

图5 NaCl 用量对回收率的影响Fig.5 Effect of NaCl dosage on recovery

结果发现，当NaCl 用量为 100 mg 时，5 种氨基甲酸酯的回收率最高，综合考虑选取100 mg 为NaCl 最佳用量。

2.6 目标物定量分析结果

样品中5 种氨基甲酸酯的含量，根据目标化合物的一级TOF-MS 高分辨质谱信息进行分析。首先利用UPLC-Q-TOF-MS 分析方法获得目标化合物的离子流色谱，5 种目标化合物配制成混合标准溶液，稀释成一系列质量浓度，获得目标化合物的校正曲线，以及线性范围；同时以3 倍信噪比和10 倍信噪比为依据，确定方法的检测限与定量限。5 种目标化合物的高分辨提取离子流图见图6。结果表明，校准曲线的相关系数r 在 0.999 0 以上，检测限为 0.02 μg/kg～0.05 μg/kg，定量限为 0.05 μg/kg～0.15 μg/kg。相关参数见表2。由定量分析结果可知，本方法检出限低，灵敏度高，可用于非靶向农药残留快速筛查。

2.7 回收率及精密度

分别对3 种基质中进行添加回收回收试验。每种基质添加0.5、1.0、5.0 μg/kg 浓度水平标准溶液，按试验方法进行测定，每个浓度水平做6 份平行样品，回收率和相对标准偏差（RSD，%）结果见表3。由表3可知，3 种不同基质样品的平均回收率范围在84.5 %～97.8%，RSD 范围在1.28%～6.88%，方法精密度及准确度良好，可用于农药残留快速筛查。

图6 5 种农药的提取离子流色谱图Fig.6 Extracted ion chromatogram of the 5 pesticides

表2 5 种质控农药的校准曲线、检测限与定量限Table 2 Analytical performance data of 5 pesticides for linearity of calibration curves，coefficient of determination，limit of dection and limitof quantitation

表3 新鲜果汁中5 种氨基甲酸酯的加标回收率（n=6）Table 3 The recoveries of five carbamate pesticides in fresh juice（n=6）

3 结论

基于DLLME 前处理，建立了DLLME-UPLC-QTOF-MS 法对新鲜果汁中5 种氨基甲酸酯类农药进行同时测定。样品在5 min 内完成提取，富集倍数高。结合UPLC 进行分离，5 种目标物在短时间内分离，且峰型良好。利用高分辨质谱的高灵敏度，对目标物的定性定量分析更为精确。方法学数据表明，该方法灵敏度高、重现性好和准确度高，为氨基甲酸酯类农药的分析测定研究提供了参考方法。