黄花倒水莲多糖的纯化、表征与体外抗氧化活性研究

张小梅，刘素莲，张锐锐，林冰梅，王晶晶，林家逊，许有瑞

（桂林医学院药学院，广西 桂林 541004）

黄花倒水莲（Polygala fallax Hemsl.）为远志科远志属灌木或小乔木，又名假黄花远志、黄花参、倒吊黄、吊吊黄、念健、一身保暖、鸭仔兜等，生于山谷林下水旁荫湿处，分布于江西、福建、湖南、广东、广西和云南[1]。其根入药，性平，味甘、微苦，具有补气血、健脾利湿、活血调经之功效[2]，可用于治疗病后体虚、腰膝酸痛、跌打损伤、急慢性肝炎，抗衰老等，为瑶、苗、壮等少数民族的常用药物[3-4]，也被作为草药中的“党参”、“黄芪”来使用[5]。现代研究表明黄花倒水莲含有多种化学成分，如皂苷、多糖、酚类、酮类、寡糖酯、有机酸等[6]。其中，多糖作为黄花倒水莲的活性成分之一能够提高机体的抗应激能力[5]，也能提高正常小鼠的非特异性免疫和特异性免疫[7]，此外黄花倒水莲多糖（polysaccharide of Polygala fallax Hemsl.，PFP）还对四氯化碳致急性肝损伤的小鼠有保护作用[8]。

基于此，本研究参照前期优选的提取工艺，对PFPs 进行提取、分离、纯化与表征，并评价其体外抗氧化活性，以期为今后对PFPs 进行更深入的研究与开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄花倒水莲根：桂林市六合路中药材市场；无水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、浓硫酸、维生素C（VC）：西陇化工股份有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3- methyl-5-pyrazalone，PMP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-2（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 [2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：Sigma 公司；葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）：中国食品药品检定研究院；葡聚糖凝胶G-75：上海蓝季科技发展有限公司。以上试剂均为国产分析纯。

BT224S 精密分析电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；CTFD-12S 冷冻干燥机：青岛永合创信电子科技有限公司；80-2B 低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；HC-3618R 高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；N-1100 旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵、DLSB-10/20 低温冷却循环泵：郑州长城科工贸有限公司；BV1005-E 漩涡混合器：上海柯淮仪器有限公司；A210049 傅立叶变换红外线光谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司；LC-20A 高效液相色谱仪：日本岛津仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄花倒水莲多糖的提取

称取一定量低温干燥的黄花倒水莲粉末（14 目），无水乙醇回流脱脂3 次（2 h/次），过滤，药渣挥去乙醇。以30 倍量蒸馏水，82 ℃水浴提取2.4 h（重复提取3次），过滤，合并滤液并减压浓缩，在浓缩液中加入无水乙醇至醇浓度为90%，于4 ℃的冰箱内静置过夜。取沉淀，经Sevag 法除蛋白，活性炭脱色，冷冻干燥后得到黄花倒水莲多糖。

1.2.2 黄花倒水莲多糖的纯化

称取10 g 葡聚糖凝胶G-75 于蒸馏水中加热溶胀，装柱（直径2 cm），用蒸馏水平衡后，称取黄花倒水莲多糖0.05 g，溶于1 mL 蒸馏水中，上样，经蒸馏水洗脱（0.3 mL/min），用具塞试管收集洗脱液（2 mL/管），取其中0.2 mL 用苯酚-浓硫酸法检测多糖，绘制黄花倒水莲多糖的洗脱曲线。依照洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥后得到不同分子量的多糖组分。

1.2.3 分子量测定

多糖组分的分子量及其分布由凝胶渗透色谱法测定（gel permeation chromatography，GPC）。GPC 色谱条件：LC20 泵，RID-20 示差折光检测器，TSKgel GMPWXL 色谱柱（7.8 mm×300 mm，13 μm），流动相为0.06% NaN3水溶液，流速为 0.6 mL/min，柱温为 35 ℃，窄分布的葡聚糖作为标准物。

1.2.4 红外光谱（infrared spectrum，IR）测定

取黄花倒水莲多糖组分适量，同KBr 混合研磨均匀，压片后进行红外光谱分析，扫描范围为400 cm-1～4 000 cm-1。

1.2.5 PFP1的单糖组成分析

1.2.5.1 单糖标准溶液的配制

分别称取甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品10 mg，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准溶液。

1.2.5.2 PFP1的水解

称取10 mg PFP1置于具塞试管中，加入浓度为3 mol/L 的TFA 1 mL，密封，摇匀后置于105 ℃油浴中水解4 h。反应结束后加入氢氧化钠溶液调节pH 值为中性，1 000 r/min 离心10 min，取上清液待用。

1.2.5.3 单糖标准品及PFP1水解产物的PMP 衍生化

分别移取各单糖标准溶液和PFP1水解产物0.5 mL，置于具塞试管中，依次加入0.3 mol/L 氢氧化钠0.5 mL，0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液0.5 mL，涡旋混匀后于70 ℃水浴加热反应1.5 h。反应结束后取出试管冷至25 ℃，加入0.3 mol/mL 盐酸溶液0.5 mL 中和，涡旋混匀后，加入氯仿萃取，涡旋振荡2 min，4 500 r/min 离心10 min，取上清液重复用氯仿萃取2 次[9]。将萃取完的上清液过0.45 μm 滤膜，待高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）进样测定。

1.2.5.4 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.05 mol/mL 磷酸盐缓冲液（pH=6.8）-乙腈（78∶22，体积比），流速为 1.0 mL/min，柱温 35 ℃，检测波长 254 nm，进样体积20 μL。

1.2.6 PFP1体外抗氧化活性

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率的测定

参照文献[10]，在试管中依次加入3 mL 不同浓度的黄花倒水莲多糖溶液与新鲜配制的1 mL 0.1 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液，摇匀，在25 ℃暗处放置30 min后，于517 nm 处测定其吸光度。以VC作为阳性对照，按下式计算DPPH 自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-A）j/Ao]×100

式中：Ai为加入多糖溶液或VC时的吸收值；Aj为只加样品时的背景吸收值；Ao为蒸馏水代替样品溶液时的吸收值。

1.2.6.2 羟基自由基清除率的测定

参照文献[11]，在试管中依次加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液，1.5 mL 1.8 mmol/L 水杨酸乙醇溶液，1 mL不同浓度黄花倒水莲多糖溶液，1 mL 0.3%H2O2溶液，摇匀，在25 ℃放置30 min 后于520 nm 处测定其吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照，按下式计算羟基自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-A）j/Ao]×100

式中：Ai为加入多糖溶液或VC时的吸收值；Aj为只加样品时的背景吸收值；Ao为蒸馏水代替样品溶液时的吸收值。

1.2.6.3 超氧阴离子清除率的测定

参考文献[12]，在试管中依次加入0.5 mL 不同浓度的黄花倒水莲多糖溶液，5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液，在25 ℃放置10 min 后加入0.2 mL 6 mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，立即在315 nm 处每30 s 测定1次吸光度，共测4 min。计算样品吸光度值随时间的变化率，以抗坏血酸作为阳性对照，按下式计算超氧阴离子自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ai为加入多糖溶液或VC时的吸收值；Aj为只加样品时的背景吸收值；Ao为蒸馏水代替样品溶液时的吸收值。

1.2.6.4 ABTS+自由基清除率的测定

参考文献 [13]，分别配制7 mmol/LABTS 溶液与2.45 mmol/L K2S2O8溶液，然后按 1∶1 体积比混合定容至25 mL，25 ℃避光反应15 h，加蒸馏水稀释54.7 倍至其在 734 nm 处吸光度为 0.70±0.02 后，30 ℃保温备用。移取该溶液0.2 mL 至试管中，再加入5 mL 不同浓度黄花倒水莲多糖溶液，充分混合，避光25 ℃反应6 min后，于734 nm 处测量吸光度，以抗坏血酸作为阳性对照，按下式计算ABTS+自由基清除率：

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ai为加入多糖溶液或VC时的吸收值；Aj为只加样品时的背景吸收值；Ao为蒸馏水代替样品溶液时的吸收值。

2 结果与分析

2.1 黄花倒水莲多糖的分离纯化

黄花倒水莲多糖经G-75 葡聚糖凝胶柱洗脱分离后的曲线如图1。

图1 黄花倒水莲多糖的洗脱曲线Fig.1 Elution curve of refined PFP on Sephadex G-75 chromatography column

如图1，得到PFP1和PFP2两个组分。然而，相对于PFP1来说，PFP2的质量极少，因此本研究只对 PFP1进行了表征和体外抗氧化活性测定。

2.2 分子量及其分布的测定

GPC 分析结果见图2。

由图2可知，可知PFP1的分子量为20 794 Da，多分散指数为1.32，表明经葡聚糖G-75 凝胶柱层析后分离得到的PFP1具有很高的纯度。

2.3 IR分析

PFP1的IR 见图3，其中具有典型的多糖吸收特征峰，包括3 369 cm-1处强而宽的O-H 伸缩振动峰，1 635 cm-1处较强的C-O 伸缩振动峰和1 413 cm-1C-H变角振动峰。

图2 PFP1的GPC色谱图Fig.2 GPC chromatogram of PFP1

图3 PFP1的IR图Fig.3 IR spectrum of PFP1

2.4 PFP1的单糖组成分析

2.4.1 混合标准单糖和PFP1水解产物PMP 衍生物的分离

混合标准单糖和PFP1水解产物PMP 衍生物的HPLC 色谱图见图4。

由图4可知，6 种标准单糖以及PFP1水解后经PMP 衍生化后的产物有着很好的分离效果。经比较保留时间得出PFP1主要是由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。但是由于选取的标准单糖数量有限，仍有一种单糖种类未被确认。

2.4.2 PFP1的单糖组成

将标准单糖溶液制成一系列不同浓度的对照品溶液，按1.2.5 的步骤进行单糖衍生及色谱分析。以对照品溶液的浓度作为Y，相应的峰面积作为X 进行拟合，得到各单糖的回归方程、相关系数及线性范围，见表1。由PFP1中各单糖的峰面积，计算得PFP1的单糖组成摩尔比为：0.09∶1∶0.48∶0.64∶0.71∶0.35。

图4 PMP 衍生物的HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of derivatives of PMP

表1 各单糖的标准曲线Table 1 Monosaccharide standard curve

2.5 PFP1体外抗氧化活性

PFP1分别对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基的清除率结果见图5。

图5 PFP1 对各自由基的清除率（n=3）Fig.5 Clearance of free radicals by PFP1

由图5可知，PFP1对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基均具有一定的清除能力，且呈现浓度依赖性关系，但其清除能力与阳性对照VC相比则较弱。当浓度为5 mg/L 时，PFP1对DPPH 自由基的清除率达到最大值81%，而VC在浓度为1 mg/L 时就达到最大清除率92%。对于羟基自由基，PFP1在浓度为7.5 mg/L 时，清除率达到最大值94.3%，而VC在浓度为0.5 mg/L 时就达到最大清除率98.5 %。对于超氧阴离子自由基，PFP1在浓度为15 mg/L 时，清除率达到最大值100.3%，而VC在浓度为5 mg/L 时达到最大清除率98.2 %。对于ABTS+自由基，PFP1的清除率达到最大值99.6 %时的浓度为2.5 mg/L，而VC达到最大清除率99.8%时的浓度则为0.25 mg/L。

3 结论

本研究通过水提醇沉法获得PFP，经Sevag 法脱蛋白、活性炭脱色以及葡聚糖凝胶-G75 柱分离纯化获得2 种PFP 组分，分别用IR、GPC 与柱前衍生PMPHPLC 法对量大的PFP1组分进行表征分析。结果显示其IR 光谱中呈现多糖的典型特征吸收峰，分子量为20 794 Da，多分散指数为1.32。而且PFP1是由甘露糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖与一种未知单糖组成的一种杂多糖，摩尔比为0.09∶1∶0.48∶0.64∶0.71∶0.35。此外 PFP1对 4 种自由基均有清除能力，且在一定范围内呈正相关。本研究为PFP 进行更深入的抗衰老方面的研究与开发利用提供理论依据。