基于下一代测序分析3种不同保鲜处理的香椿在贮藏期间微生物多样性变化

林少华，陈存坤，张慧杰，罗红霞，*，王丽琼，崔梦娇，许文涛，邓毛程，*

（1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津 300457；4.广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东 广州 510300；5.中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083）

香椿（Toona sinensis）又名椿芽，作为一种中国特有的木本蔬菜，风味独特，保健功效显著，是名副其实的绿色蔬菜[1]。香椿含有的活性成分，如黄酮、皂甙、萜类和内酯等，具有清除人体中的自由基，抑制细菌生长和消除炎症等作用[2-3]。然而，香椿季节性强，嫩芽水分含量高，采后呼吸旺盛，容易发生萎蔫、脱叶和腐烂等现象，贮藏期和货架期较短。在常温下放置1 d～2 d已基本失去商品价值，贮藏和运输的难度较大，严重制约了香椿产业的发展[4]。

为了延长香椿的贮藏期，研究者单独或者联合使用了物理（控温、控湿、减压和气调等）、化学（吸附型、防腐型和抑制型保鲜剂）以及各类生物制剂等保鲜方法[5-8]。大多从感官（如失重率、L*值、a*值和 b*值），理化（如呼吸率、乙烯生成率、叶绿素、酚类、可溶性糖等）和酶活（多酚氧化酶、过氧化酶、过氧化氢酶和超氧化酶等）等指标对香椿贮藏的结果进行评价。然而，对新鲜香椿贮藏期间微生物数量及群落多样性的变化的研究较少。赵芳等[9]发现，经过不同冷杀菌处理的半加工香椿在常温贮藏过程中，细菌总数明显的升高。即使蔬菜贮藏在低温环境中，微生物的数量仍会增加[10]，这些微生物的种类非常丰富，包括不同门类的细菌和真菌，其中一些腐败菌的增长与蔬菜的腐烂变质有很强的正相关[11]。但是传统的依靠于可培养微生物检测方法不能全面地鉴别菌群种类而导致不可培养微生物信息的缺失。而近些年发展起来的下一代测序技术（基于illumina 平台的高通量测序技术）具有准确率高、信息量全，能够快速地分析出复杂微生物群落的多样性等优点，已被广泛应用于食品加工[12]、植物生长[13]、土壤和水体环境[14-15]、人体健康[16]等领域的研究。在果蔬贮藏保鲜领域，Abdelfattah 等[17]发现通过下一代测序技术首次发现了苹果表面许多未知的真菌类群，青霉属在受伤的果皮中占优势，链格孢属在花萼和茎端中占优势。Diskin 等[18]发现引起贮藏期间芒果茎端腐烂的主要病原菌是链格孢菌（Alternaria alternata）和色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。但是采用下一代测序技术分析蔬菜在贮藏期间微生物多样性的研究仍未见报道。

本文以香椿为研究对象，在研究了聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）保鲜膜，及其与紫外（ultraviolet irradiation，ZW）照射结合、与1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP） 结合、与乙烯吸附剂（ethylene absorbent，EA）结合的保鲜处理对香椿贮藏品质影响的基础上，采用下一代测序技术，通过对细菌的16S rDNA V57 区和真菌ITS 1 区进行测序，进一步分析了这3 种不同保鲜方法处理的香椿表面细菌和真菌的多样性，从而为更好地延长香椿的货架时间并提高其贮藏品质，以及为其他果蔬的贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香椿：北京市门头沟区雁翅镇苇子水村。

1-甲基环丙烯：陕西咸阳西秦生物公司，每袋净含量0.3 g；乙烯吸收剂（EA）：山西省农业科学院，每袋净含量8 g，有效成分为高锰酸钾（质量分数≥10%）；PVC 膜：国家农产品保鲜工程技术研究中心，厚度0.01 mm，伸长率365.525%，抗张强度13.005 MPa，透气性 1 213.27 cm3/2 h·0.1 MPa，透湿率 61.82 g/m2·24 h；三羟甲基氨基甲烷（分析纯）：美国Amresco 公司；宏基因组DNA 提取试剂盒25T/50T：北京福德安科技（北京）有限公司；10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA 聚合酶、上样缓冲液6×Loading Buffer：宝生物工程（大连）有限公司；引物：Thermo Fisher Scientific 公司合成；2 000 bp marker：赛默飞世尔科技公司；高通量测序试剂：诺禾致源生物信息技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ZQJ-254 型紫外强度计：上海顾村电光仪器厂产品；短波紫外线保鲜照射箱：国家农产品保鲜中心（天津）产品；MDF-382E 超低温冰箱：日本三洋电机公司；3K15 离心机：上海希格玛高技术有限公司；5804 R 离心机：艾本德中国有限公司；ALD1244 PCR 扩增仪、CFX96 定量PCR 仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；E 凝胶成像仪：美国 UVP 公司；Miseq 高通量测序仪：美国Illumina 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

挑选新鲜、无病虫害、成熟度和大小基本一致的香椿随机分为5 组，每组重量为400 g，分别进行如下处理：①CK 组（对照组），不做任何保鲜处理；②PVC组，选用0.01 mm 厚度的PVC 膜包裹；③PVC+ZW 组，在PVC 膜包裹的条件下，每隔10 d 紫外照射1 次，灯管功率为40 W，强度为 375 μW/cm2，时间为 10 min；④PVC+1-MCP 组，在PVC 膜包裹的条件下，加入1 包1-MCP；⑤PVC+EA 组，在 PVC 膜包裹的条件下，加入1 包EA。所有处理组均置于温度为（1±0.5）℃，湿度为（90±5）%的冷库中贮藏，设置3 次重复，取样时间分别为 0、10、20 d 和 30 d，每次样品置于-80 ℃超低温冰箱中进行冷冻保存，备用于微生物多样性的检测。

1.3.2 基因组DNA 的提取

按照福德安DNA 提取试剂盒的说明提取香椿表面微生物总的DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度。

1.3.3 PCR 扩增及测序

对细菌16S rDNA 的V57 区域和真菌的ITS 1 区域进行扩增，根据测序区域的选择，使用表1所示的特异引物。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系（30 μL）：Phusion Master Mix（2×）15 μL，Primer（2 μmol/L）3 μL（6 μmol），gDNA（1 ng/μL）10 μL（5 ng～10 ng），H2O2μL。反应程序：98 ℃预变性 1 min；30 个循环包括（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min。PCR 产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据PCR 产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×TAE 浓度为2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，然后割胶并使用GeneJET 胶回收试剂盒回收目标条带。使用New England Biolabs 公司的NEBUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测，合格后，使用HiSeq 进行上机测序。

表1 细菌、真菌的PCR 扩增引物设计Table 1 Design of PCR amplification primers for bacterial and fungi

1.3.4 数据处理

根据Barcode 序列和PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode 和引物序列后使用 FLASH（V1.2.7）[19]对每个样品的 reads 进行拼接，得到的拼接序列为原始数据（raw data）；测序得到的原始数据，存在一定比例的干扰数据（dirty data），为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据（clean data）。基于有效数据，通过 QIIME（V1.7.0）[20]的质量控制流程，进行如下操作：（1）Tags 截取：将原始 Tags 从连续低质量值（默认质量阈值为≤19）碱基数达到设定长度（默认长度值为3）的第一个低质量碱基位点截断；（2）Tags 长度过滤：Tags 经过截取后得到的Tags 数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags 长度75%的Tags。经过以上处理后得到的Tags 需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags 序列通过与Gold database 数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。

1.3.5 Operational Taxonomic Units（OTUs）聚类、物种注释及多样性分析

将所有样品的全部最终有效数据利用Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，同时选取OTUs 的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs 中出现频数最高的序列作为OTUs 的代表序列。对OTUs 代表序列进行物种注释，用Mothur 方法与SILVA 的SSUrRNA 数据库[21]进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1），获得分类学信息并分别在各个分类水平上统计各样本的群落组成。利用Excel、SPSS、R 语言等软件对OTUs 数据进行α 多样性指数进行计算和对比分析。

2 结果与讨论

2.1 样品测序数据

采用下一代测序技术对3 种不同保鲜处理的香椿进行测序，测序结果见表2。

细菌16S 高通量测序结果显示，5 组的有效数据的范围为 165 690 bp ～ 305 049 bp（CK 组在第 10 天后已经全部腐烂，因此未对其后续进行取样检测），碱基平均长度范围为373 bp～376 bp，在97%相似水平下的OTUs 生物信息统计发现，各组样品中总OTUs 数的范围为 352～856，其中，PVC+ZW 组的 OTUs 数最低。真菌ITS 测序结果与细菌的结果相似，PVC+ZW 组的总OTUs 数最低为407。

表2 样品中细菌和真菌有效序列与OTUs 数量统计Table 2 Observed valid sequences and OTUs of bacterial and fungi in different samples

2.2 样品多样性指数分析

本文通过分析3 种不同保鲜处理后的香椿的OTUs 及 Simpson、Shannon 和 Chao 指数等多样性指标，对各个组样品中的细菌和真菌的多样性和丰富度进行了评估，结果如图1和图2所示。

图1 箱型图绘制的各组样品中观察到的细菌OTUs 和多样性指数Fig.1 Box-plot of observed OTUs and diversity of bacterial community in different group

图2 箱型图绘制的各组样品中观察到的真菌OTUs 和多样性指数Fig.2 Box-plot of observed OTUs and diversity of fungi community in different group

箱型图结果表明，PVC+ZW 组的细菌OTUs 数与PVC+1-MCP 组差异不显著，但与PVC+EA 组差异显著，与PVC 组和CK 组差异极显著（图1A）。PVC+ZW组的真菌OTUs 数与PVC+1-MCP 组和PVC+EA 组差异不显著，但与PVC 组和CK 组差异显著（图2A）。经过紫外照射的香椿表面的细菌和真菌的Simpson、Shannon 和Chao 指数都是最低的，其中，细菌的Simpson 和 Shannon 指数均与 CK 组和 PVC 组差异显著，而真菌则差异极显著。但是细菌的Chao 指数与CK 组和PVC 组差异不显著，但真菌差异显著。与加了1-MCP和EA 保鲜剂的处理组相比，PVC+ZW 组细菌的Simpson 和Shannon 指数与PVC+1-MCP 组差异不显著，但Chao 指数差异显著；与PVC+EA 组比，Simpson指数差异显著，但Shannon 和Chao 指数差异不显著。真菌方面的比较则显示，PVC+ZW 组细菌的Simpson和Shannon 指数与PVC+1-MCP 组和PVC+EA 组差异显著或者极显著，但Chao 指数差异显著。因此，紫外照射能够降低菌群的多样性。紫外照射主要通过消除食品表面的微生物或者食源性病原体来减少其腐败的一种处理技术，它可以在DNA 中相邻的嘧啶碱基之间产生交联，诱导DNA 损伤和形成嘧啶二聚体，其光产物能够阻碍DNA 复制和转录及改变了磷酸糖的骨架，从而导致微生物死亡[22]。近年来，国内外学者的研究表明紫外照射可以有效延缓果蔬腐烂，延长其保质期[23-24]。

2.3 香椿贮藏过程中菌落组成的变化

2.3.1 细菌门和目分类水平的变化

3 种不同保鲜方法处理的香椿在贮藏过程中细菌在门和目分类水平上的相对丰度如图3所示。

由图3可知，通过下一代测序，一共发现了6 个门，分别为放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria），还有一个门未确定。其中，由图3A 可知，Cyanobacteria 是香椿贮藏期间的优势门，它们通过光合作用获得能量，具有固氮能力和对不良环境的抵抗能力[25]。PVC+ZW 处理的香椿在贮藏期间，Cyanobacteria 占有绝对的优势，这表明紫外照射对其他门类的细菌具有较高的杀灭作用。其他4个处理组随着贮藏时间的延长，Proteobacteria 的相对丰度逐渐增加并成为了第二优势门（图3B），但其对人类健康具有潜在的威胁[26]，通过进一步对目水平进行分析发现，假单胞菌目（Pseudomonadales）在贮藏后期逐渐成为优势目，其含有一些可能引起肺炎的条件性病原菌，如假单胞菌（Pseudomonas）、莫拉菌（Moraxella）和不动杆菌（Acinetobacter）等。

图3 门和目水平下细菌群落结构分布图Fig.3 Distributions of bacterial communities at phylum and order level

2.3.2 真菌门和目分类水平的变化

3 种不同保鲜方法处理的香椿在贮藏过程中真菌在门和目分类水平上的相对丰度如图4所示。

由图4可知，通过测序发现，香椿在贮藏期间有3个门，包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和接合菌门（Zygomycota），其中，Ascomycota和Basidiomycota 是优势门，它们腐生的方式可以导致香椿霉烂及残体的分解。从图4A 可以看出，PVC+ZW处理组中Ascomycota 是绝对优势门，但Basidiomycota的相对丰度也随时间的延长而增加。其他4 个处理组中，Basidiomycota 逐渐成为第一优势门。通过目水平进行分析发现，PVC+ZW 处理组中座囊菌目（Ascomycota）是优势目，说明其对紫外照射的抗性较高。但其他目的丰度也逐渐增加，这可能与间歇式紫外照射有关，当真菌暴露在紫外照射时，它们会被杀死，产生的孢子也会减少，但不再紫外照射时，这些残存的孢子又会恢复，而且随着真菌年龄的增长，它们的抵抗力也会进一步上升[27]。在其他处理组中，多孔菌目（Polyporales）成为了优势菌目，含有1 800 种真菌，而且绝大多数种类都是以腐生为主，通常出现在死的或者垂死的植物上。部分种类能够降解影响蔬菜品质的木质素、纤维素和半纤维素，因此是导致蔬菜的软腐病的重要致病菌[28]。

2.3.3 主成分和共现网络分析

主成分分析（principal components analysis，PCA）可以在二维坐标图的角度上清晰地比较不同处理间微生物群落组成结构的特征和差异。点与点之间的距离远近表示菌落组成差异性的大小。本研究采用主成分分析对3 种不同处理的香椿在贮藏期间的微生物群落的特征和差异进行比较，结果如图5所示。

图4 门和目水平下真菌群落结构分布图Fig.4 Distributions of fungal communities at phylum and order level

图5 各组样品中微生物群落主成分分析图Fig.5 The principal coordinate analysis of microbial communities in different group

由图5可知，PC-1 和PC-2 分别解释了各个处理组中微生物群落76.40 %和13.16 %的信息，共计89.56%，因此，这两个成分能够代表样品中的微生物群落信息。PVC+ZW 处理组的距离较近，说明它们的微生物群落相似性高，群落的稳定性较高，说明在贮存过程中，菌群变化不大，这种处理方法较好的抑制了微生物的生长，从而保证了香椿的贮藏品质。而其他4 个处理组的微生物群落的距离随时贮藏时间的延长而变得离散，说明各个处理组间及每个处理组内的微生物群落差异性较大。

基于强相关性的网络图，能够可视化地研究不同微生物群落之间的共现模式[29]。本研究采用共现网络法对3 种不同处理的香椿在贮藏期间的微生物群落之间相关性进行分析，结果如图6所示。

在本研究中，细菌组标为浅灰色的圆圈（节点），真菌组标为深灰色的圆圈，圆圈之间的连线（边）代表了它们之间具有较强的相关性（皮尔逊相关系数r ＞0.7或者r ＜-0.7），深灰色边代表正相关，浅灰色边代表负相关，节点的大小（度）与其连接的边的数量成正比。PVC 处理的网络图有234 条边，包括70 条负相关的边，占29.91%（图6A）；PVC+ZW 处理的网络图有170条边，包括65 条负相关的边，占38.24 %（图6B）；PVC+1-MCP 处理的网络图有188 条边，包括68 条负相关的边，占36.17%（图6C）；PVC+EA 处理的网络图有203 条边，包括63 条负相关的边，占31.03%（图6D）。因此，紫外照射提高了菌群之间的负相关性，这也意味着在有紫外线照射的环境中菌群的拮抗关系得到加强。

图6 各组样品中微生物群落共现网络图Fig.6 Co-occurrence Network of microbial communities in different group

3 结论

本研究采用下一代测序技术，对不同保鲜处理的香椿在贮藏期间微生物多样性进行分析。结果表明，PVC+ZW 处理的香椿在贮藏过程中，观察到的OTUs以及多样性指数（Simpson、Shannon 和 Chao 指数）均有所下降。一直保持优势的细菌门为蓝菌门（Cyanobacteria），优势的真菌门为子囊菌门（Ascomycota），但担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度也在不断地增加。主成分分析表明，PVC+ZW 处理组的各个样品距离较近，微生物群落相似性较高，群落的稳定性较高。共现网络分析发现，紫外照射提高了不同菌群之间的负相关性。本试验从细菌和真菌的多样性角度进一步解释了PVC+ZW 处理的香椿在贮藏期间能够较好地保持品质的原因。因此，PVC+ZW 处理可以更好地延缓香椿的腐烂变质并且有效地抑制致病细菌的生长，从而延长其货架期，保证其贮藏品质与安全。