壶腹癌中B7-H1 和B7-H4的表达及与肿瘤T 淋巴细胞浸润的关系

祁紫娟 吴鹤鸣 周照旭 姜虹

抗肿瘤免疫以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主。T细胞的活化需要TCR介导的抗原信号和协同刺激分子提供的第二信号共同作用[1]。B7-CD28家族是重要的协同刺激分子，其成员有些是激发或增强免疫应答，有些是下调或终止免疫应答。B7-H1、B7-H4是B7-CD28家族新近发现的负性协同刺激分子，可通过抑制T细胞的活化和增殖来负调控T细胞的免疫应答[2]，并已发现在多种肿瘤组织（如肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等）中异常表达，使人们注意到其在肿瘤的发生发展中的作用，与肿瘤的免疫逃逸有关。但B7-H1、B7-H4在壶腹癌中的表达情况未有文献报道。为对临床下一步研究工作提供借鉴，本研究应用免疫组织化学染色，检测壶腹癌中B7-H1、B7-H4的表达及其与肿瘤浸润T淋巴细胞的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

黑龙江省医院2011年6月—2018年6月外科手术切除的壶腹癌标本62例，其中18例正常组织来源于肿瘤组织的癌旁部分。试剂：鼠抗人B7-H1及B7-H4单克隆抗体来自博奥森生物技术有限公司。CD3，CD8，CD68及检测试剂盒均来自北京中杉公司。

1.2 免疫组织化学染色

采用PV-6000-G二步法。肿瘤组织标本10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μm 连续切片，二甲苯脱蜡，阶梯酒精内水化；PBS液浸泡3次，每次5 min（3×5），浸于枸橼酸盐缓冲液1800 W高压修复组织抗原1.5 min.，PBS冲洗3×5；3% H2O215分钟阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3×5；除去PBS液，加入一抗4℃孵育过夜；PBS冲洗3×5，滴加通用型二抗孵育30 min，PBS洗涤; DAB显色；蒸馏水冲洗；苏木素复染；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 染色结果评估

以细胞膜或细胞浆出现黄至棕褐色颗粒为阳性染色，在高倍镜下随机选择5个肿瘤区域进行细胞计数。B7-H1、B7-H4的染色强度根据阳性细胞的百分比进行半定量分级。结果判断：＜20%为阴性；20%～100%为阳性。CD3+/ CD8+T淋巴细胞的数量为随机选择的5个癌视野在高倍镜下细胞计数的平均值。

1.4 统计学分析

本研究选择 SPSS 19.0 统计学软件，所涉计数数据表示方法及检验方法分别为%和χ2检验，而所涉计量数据表示方法和检验方法分别为均数±标准差和t检验，判定形成统计学意义的标准为 P＜0.05。

2 结果

2.1 B7-H1、B7-H4在不同壶腹部组织中的表达

免疫组化结果显示，壶腹癌组织中B7-H1、B7-H4阳性染色定位在肿瘤细胞胞质和胞膜，呈弥漫性表达，大多数位于肿瘤实质腺体上皮细胞，肿瘤浸润淋巴细胞不表达两者。在62例壶腹癌中，B7-H1表达的阳性率为80.65%（50/62）；B7-H4表达的阳性率为82.26%（51/62）；B7-H1和B7-H4双阳性表达45例，占72.58%，双阴性6例，占9.68%.B7-H1和B7-H4表达呈正相关，相关系数rs=0.809，P ＜0.01。癌旁正常壶腹部组织中，B7-H1、B7-H4表达较弱或不表达，阳性率分别为38.89%（7/18）和44.44%（8/18），与其在壶腹癌组织中表达情况比较，差异有统计学意义（χ2=11.824，13.479，P＜0.01）。见表1。

2.2 B7-H1、B7-H4表达与肿瘤T细胞浸润的关系

壶腹癌组织中CD3和CD8标记的肿瘤浸润T淋巴细胞阳性定位于胞膜。CD3+T、CD8+T细胞呈圆形或椭圆形，大部分聚集在癌巢周边的间质，呈灶状分布；少数可浸润癌巢，直接与肿瘤细胞接触。B7-H1阳性标本的CD3+T、CD8+T细胞明显低于B7-H1阴性标本。B7-H1阳性表达与CD3+T数量呈负相关（rs=-0.781，P＜0.01），与CD8+T无关（rs=0.046，P＞0.05）。B7-H4阳性中CD3+T、CD8+T低于B7-H4阴性中CD3+T。CD3+T、CD8+T数量与B7-H4阳性表达呈负相关（rs=-0.752，rs=-0.807；P＜0.01）。见表2，表3。

3 讨论

壶腹癌是指生长于十二指肠乳头及附近黏膜、壶腹内黏膜、胰管开口及胆总管下段黏膜的恶性肿瘤[3]，免疫系统缺陷、宿主对肿瘤抗原缺乏反应，使肿瘤细胞逃避免疫系统的监督是其发生和发展的重要因素。近年来，围绕肿瘤的免疫逃逸机制做了多方面研究，介导T细胞共刺激信号转导通路的B7-CD28家族是其中的一个热点，B7-H1和B7-H4是新近发现的B7家族成员，提供负性信号来限制、终止或削弱T细胞免疫应答。

B7-H1的受体是PD-1，B7-H1与其结合后发挥抑制效应，抑制T细胞增殖活化、诱导活化的T细胞发生凋亡、IL-2分泌，从而负性调控机体的特异性细胞免疫应答，参与肿瘤免疫逃逸的发生[4]。B7-H4mRNA在肾、子宫、睾丸、肝、脾等多种人类组织上广泛表达，蛋白水平上在人正常组织中却未检测到其表达。本研究发现，壶腹癌组织中B7-H1、B7-H4在肿瘤细胞胞质和胞膜呈弥漫性表达，大多数位于肿瘤实质腺体上皮细胞，肿瘤浸润淋巴细胞不表达两者。其阳性率明显高于癌旁正常壶腹部组织中B7-H1、B7-H4的阳性率（P＜0.01），有统计学意义。结合两者在其他肿瘤组织中的文献报道，提示B7-H1和B7-H4确实参与了壶腹癌的发生[5]。笔者认为：在将来，需要进一步收集组织标本和患者的预后资料，来证实B7-H1和B7-H4共同表达的壶腹癌患者的死亡风险及预后的关系，有重要的临床应用价值。

表1 B7-H1、B7-H4 在不同壶腹部组织中的表达（%）

表2 B7-H1 表达与肿瘤T 细胞浸润的关系（个/μL）

表2 B7-H1 表达与肿瘤T 细胞浸润的关系（个/μL）

B7-H1 表达 CD3+T CD8+T阳性（50） 83.3±15.7 43.1±9.7阴性（12） 100.8±14.3 51.3±12.7 t 值 3.521 2.473 P 值 ＜0.01 ＜0.05

表3 B7-H4 表达与肿瘤T 细胞浸润的关系（个/μL， ）

表3 B7-H4 表达与肿瘤T 细胞浸润的关系（个/μL， ）

B7-H4 表达 CD3+T CD8+T阳性（51） 81.5±12.9 41.4±8.5阴性（11） 110.9±11.3 59.8±6.5 t 值 6.992 6.749 P 值 ＜0.01 ＜0.01

为了了解壶腹癌中B7-H1和B7-H4表达与T淋巴细胞浸润的关系，本实验专注检测完全浸润的T细胞数量作为其是否增殖的标志[6]。尽管这种方法不能准确说明T细胞是否活化的问题，但有理由相信，如果B7-H1和B7-H4发挥其负性调控免疫应答中抑制T细胞增殖的作用，会使组织中T细胞的数量明显减少。CD3检测所有的T细胞的数量，CD8标记CTL[7]。结果发现，B7-H1、B7-H4阳性壶腹癌标本中CD3+T、CD8+T细胞的数量明显低于其阴性标本，B7-H1阳性表达与CD3+T数量呈负相关（P＜0.01）；CD3+T、CD8+T数量与B7-H4阳性表达呈负相关（P＜0.01）。这些研究结果提示，B7-H1和B7-H4通过负性调控T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞逃避免疫系统的监督，抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤的进展。

癌组织内浸润的巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）,可以促进肿瘤细胞的增殖、抑制自然杀伤细胞（NK）和T淋巴细胞的抗肿瘤活性，其浸润数量与恶性肿瘤的某些生物学行为和预后密切相关[8]。有关研究发现[9-11]，卵巢癌组织中，TAM表面表达B7-H4，抑制T细胞免疫。而在本实验中，只观察到少数的巨噬细胞胞质B7-H4呈微弱表达而不是表达于细胞表面。这可能由于B7-H4被巨噬细胞的吞噬机制所吸收，而不是TAM本身表达B7-H4，需要进一步的实验确定TAM的B7-H4来源。B7-H1和B7-H4表达情况与TAM数量的关系尚未有研究报道，具体作用机制也未阐明。B7- H1阳性、B7-H4阳性标本癌细胞周围的炎症反应增强，作为重要的炎症反应细胞TAM增多，抑制T细胞增殖，从而介导免疫抑制效应。同时TAM也表达淋巴内皮生长因子受体（VEGF-C）,通过刺激肿瘤淋巴管的形成促使肿瘤细胞的淋巴结转移[12]。

综上所述，负性协同刺激分子B7-H1和B7-H4在壶腹癌组织中高表达，与T细胞数量有关，参与壶腹癌细胞的免疫逃逸。