橄榄油中农药多残留前处理方法研究及其应用于气相色谱、气质联用测定效果评估

苏建峰 陈劲星 连文浩 马 莹 徐 佳 沈 松 刘建军,

(福建中检华日食品安全检测有限公司1，福州 350008) (空军第一后勤训练基地2，上海 200120)(中国检验认证集团福建有限公司3，福州 350015)

橄榄油是由新鲜的油橄榄果实冷榨而成，不经加热和化学处理，保留了天然营养成分，营养价值高。由于橄榄在种植和生长过程中使用农药用于防治虫害，且部分农药不易降解，致使橄榄油中可能存在农药残留。橄榄油中含有大量油脂，基质干扰大，属于较难分析的样品类型。由于农药多残留技术[1-10]监测项目范围广，优势显著，近年来已有不少植物油中农药多残留分析的研究报道[11-20]，主要采用凝胶渗透色谱[13-15](GPC)净化、色谱质谱联用分析，GPC在油脂净化方面效果较好，但需要专门设备，并且效率不高；其他如冷冻、分散固相萃取法等[16-17]快速法效率较高，但对油脂中大量干扰基质的净化效果一般，常需配合二级串联质谱(LC-MS/MS、GC-MS/MS)的强抗干扰性进行分析，且基质效应较强影响定量结果；传统的液液分配法、固相萃取法等[18-19]多用于分析某一两类(如有机磷类、菊酯类等)农药几种或几十种，适用范围较窄。

本研究建立并优化串联双柱净化方案，用于橄榄油中农药多残留分析前处理，操作迅速、适用项目范围远超已有的文献报道(在进出口农药筛查品种的基础上进一步扩充，跨种类达313种农药)，并且项目列表中包含了多残留分析技术较难并入的部分农药如：乙酰甲胺磷、百菌清等。在仪器测试方面，考察了该前处理净化方案在不同仪器上的效果，结果表明，各仪器的谱图均呈现较优的净化效果，可依据具体情况选择配合GC-MS、GC-ECD或GC-FPD进行测定，实用性强，满足高通量样品的检测需求，文中对实验的前处理和仪器测定参数进行了探讨。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，7683自动进样器，EI源；Clarus 680气相色谱仪，ECD检测器，FPD检测器；色谱柱：DB-5MS毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，HP-5毛细管柱30 m×0.32 mm×0.25 μm，DB-1701毛细管柱30 m×0.32 mm×0.25 μm；313种农药标准品(逐级稀释后备用)；Envi-18、PSA固相萃取小柱。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取5 g橄榄油至烧杯中，加入20 mL正己烷，充分搅拌混匀后倒入250 mL分液漏斗中，5 mL正己烷清洗烧杯后并入分液漏斗，在分液漏斗加入30 mL正己烷饱和乙腈、10 mL饱和氯化钠，振荡静置分层，弃去下层氯化钠水溶液，收集中间乙腈层经漏斗滤入鸡心瓶中(漏斗上预置无水Na2SO4层)，再用30 mL正己烷饱和乙腈萃取一次，合并萃取液至鸡心瓶中，40 ℃减压旋转蒸发至约2～5 mL，过Envi-18和PSA串联双柱(10 mL乙腈预活化)，5 mL乙腈清洗鸡心瓶(配合超声波)后一并上柱，用乙腈继续洗脱，全部收集，至洗脱液达到20 mL时停止，在40 ℃减压旋转蒸发至近干，用丙酮+正己烷(1+1)溶剂定容至1 mL上机。

1.2.2 色谱和质谱条件

气相色谱条件：ECD，载气为氮气(纯度为99.999%)，流速2.0 mL/min，进样口温度为260 ℃，进样量为1 μL，不分流进样，检测器温度为300 ℃。FPD，载气为氮气(纯度为99.999%)，流速为2.0 mL/min，尾吹流量为60 mL/min，氢气(纯度为99.999%)流量为75 mL/min，空气流量为100 mL/min。进样口温度为220 ℃，进样量为1μL，不分流进样，检测器温度为250 ℃。

气相色谱-质谱条件：载气为氦气(纯为度99.999%)，恒流模式，流速为1.0 mL/min，进样口温度为260 ℃，进样量为1 μL，不分流进样，色谱-质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，离子化方式为EI，电子能量为70 eV，倍增器电压在自动调谐后加400 V。313种农药的色谱分离谱图见图1, 其他相关参数见表1。

图1 313种农药混标选择监测总离子流色谱图

表1 选择离子监测待测农药的保留时间、定量离子、定性离子

续表1

续表1

注：黑体为定量离子。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

橄榄油的主要成分为油脂，它的存在会对后续分析带来强烈的干扰，乙腈中可溶入的油脂量极少，对绝大多数农药溶解度则较大，故采用乙腈来作为橄榄油中农药残留的提取溶剂。实验中先使用正己烷对橄榄油进行溶解，乙腈反提取，正己烷-乙腈-盐水三相分配，其中油脂溶于正己烷相，水溶性杂质溶于水相，农药组分转移至乙腈相中，随农药组分进入乙腈相的部分油脂和其他杂质则采用SPE手段进行净化。

试验Envi-18柱、PSA柱、NH2柱、Carb柱、Florisil柱的各种组合对本实验提取液的净化效果。由于油脂是主要干扰杂质，故Envi-18柱必选；Florisil柱中的镁化硅胶会对极性农药产生强吸附，象甲胺磷、氧化乐果等农药回收率极差，加强洗脱溶剂的极性也不能有效改善，故该柱由于其适用范围窄而排除；Carb柱中含层状石墨碳结构，某些农药分子中含平面环状结构，此结构与石墨碳中的六方层状结构产生强吸附，很难洗脱，导致回收率大幅下降，若一定要洗脱来提高回收率的话，必需使用含高比例甲苯或苯的溶剂，这直接导致该柱与Envi-18柱组合使用时除油脂的效果很差，也排除；PSA柱和NH2柱效果相当，由于相同规格的PSA柱比NH2柱吸附容量大，故选用PSA柱与Envi-18柱组合成串联双柱。双柱分别吸附非极性和强极性杂质，互为补充，其中，Envi-18柱的硅胶骨架上的十八烷基官能团在与乙腈配合使用时对油脂的去除有十分显著的效果，同时还可以除去其他一些非极性的杂质如色素中的非极性组分等[5,9]。PSA柱的硅胶表面键合有极性官能团，它能利用氢键吸附的原理从样品中吸附极性化合物[9]，与乙腈配合使用时，绝大部分农药均可定量洗脱，而强极性杂质如有机酸、部分色素等还吸附在PSA填料上。实验时双柱串联，仅使用一种溶剂过柱，简单快速，实际操作时，应在活化时先控制好流速，可采用预调节方法来实现平稳的流速：先用乙腈调节，若流出不畅，可摘下Envi-18柱让PSA柱上的乙腈自行往下流，流速合适时迅速插上Envi-18柱，即可获得整体平稳的流速，然后将提取液上柱，以免串联柱内形成内压导致洗脱液流出不畅。

2.2 气相色谱-质谱条件的优化

一般建立气质联用测定几百种农药多残留的仪器条件较为耗时繁琐，本研究在配合质谱库和相关文献[4,7]参数的情况下，采用速成法进行：

先配置1～5 mg/L混合标准溶液，采用质谱全扫描方式、通用型气相柱温程序进行走样，设定较长的高温程序段，以确保高沸点农药组分可以流出色谱柱，此时观察谱图中色谱峰的分布，对柱温程序进行精细调节：色谱峰较密集的区域，减缓该区域对应保留时间段的升温速率，反之，则加快速率，综合考虑效率对柱温进行调整，使整张谱图中色谱峰的分布相对均匀，值得注意的是，柱温程序的变化对出峰时间的影响具有滞后性，部分目标区域的调节效果不佳，此时将调节区域提前，可获得不同的分离效果。

依据质谱库和相关文献参数确定各农药组分的可能特征离子，再利用各农药组分的特征离子确定保留时间，对于无法确认归属的少量农药组分(如：响应值较低、同分异构体、相似结构等)则需使用单标进行确认。同时，通过调整气化温度对特殊农药是否分解、是否无法气化等加以确认，将个别无法使用气质联用测试的农药剔除出去。

通过综合考查特异性、丰度比、质量数的因素，挑选3个离子进行监测，再依据步骤2中确认的保留时间来分组，调整驻留时间(Dwell time)使每组的循环扫描次数在每秒3次左右，保证每个完整的离子流色谱峰包含足够的采点数，以免峰形失真影响精密度。

2.3 气相色谱-质谱测定结果

采用本法处理的某进口初榨橄榄油样品选择监测总离子流色谱图见图2(B组)，如图所示：总离子流色谱图中没有出现成片的或比例非常悬殊的杂质峰，在保留时间为36～36.5min有一个较大的杂质峰，经优化分离条件后，仅2个农药(氟苯嘧啶醇、戊唑醇)在该区域出峰，这2个农药的定量离子为m/z 314、m/z250，离子质量数较大，不受该种程度的杂质峰的影响，其他位置的干扰峰都较小。经优化监测离子，本前处理方法所处理的橄榄油中各农药的定量离子基本不受基质干扰，有少部分农药的定性离子有干扰，由于此部分离子仅供定性用，故其干扰幅度尚可接受。该进口初榨橄榄油中检出的2种农药提取离子流色谱图如图2所示：倍硫磷检出值为0.032 mg/kg，腐霉利检出值为0.11 mg/kg，m/z153谱图基线抖动，并且在靠近该峰的前部有小幅干扰，这是因为m/z153离子质量数和丰度比均较小，抗干扰性不强，容易受到干扰，在本研究中，该离子仅供定性用，不涉及准确定量，故满足实验要求。其他离子m/z278、m/z169、m/z285、m/z283、m/z255的谱图均没有干扰，信噪比很高。

图2 初榨橄榄油样品选择离子监测总离子流色谱图及阳性农药(倍硫磷、腐霉利)提取离子流色谱图

2.4 气相色谱测定结果

图3 某进口初榨橄榄油样品的GC-ECD色谱图(检出腐霉利)

试验考察了本前处理的净化方案在气相色谱(GC-ECD、GC-FPD)上的适用性。GC-ECD谱图见图3：图中有相当数量的杂质峰，这是因为ECD检测器虽然灵敏度高，但选择性一般，许多杂质也含有电负性基团导致在谱图中形成干扰信号，由于干扰信号强度不大，谱图放大后其基线情况还是可以接受的。本例进口初榨橄榄油样品中检出腐霉利0.11 mg/kg，其实际信噪比很高，完全满足定量要求，由于有机氯和拟除虫菊酯类农药在ECD检测器上普遍响应值很高(腐霉利算相对低的)，而杂质峰的高度相对于目标物来说不算高，并且各杂质峰峰形较尖锐，所以本法中，有机氯和拟除虫菊酯类农药很容易通过放大谱图、调整升温程序或更换色谱柱实现与杂质峰的分离，进而进行定性定量。GC- FPD谱图见图4：由于FPD检测器的高选择性，未出现较大的杂质峰，在保留时间约为9.2、10.9、14.1 min处有很小的杂质峰，在保留时间约为16.8、17.7min处有轻微基线抖动。经观察，基线抖动只是个别批次实验时出现，大部分情况下没有，将色谱柱设置280 ℃烘烤2 h后重新走样，发现该处的基线回复为平线，这是由于色谱柱中残留有少量高沸点物质，在高温阶段流出色谱柱，进入火焰光度检测器时，影响到检测器中氢火焰的燃烧状态，使氢火焰的发光强度等发生变化[3]，同时由于它们在气化后体积膨胀，而色谱柱内径较细，无法同时流出色谱柱，最终呈连续流出状态导致基线出现轻微的抖动。由于这些杂质峰和基线抖动幅度都非常小(参照图4中0.032 mg/kg倍硫磷的响应值)，相对于有机磷农药的响应值来说基本可忽略不计，整体信噪比非常高，可进行定性定量。对于出峰时间较早的几种有机磷如甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果等，GC-FPD法的检出限比GC-MS法做得更低，均可达到0.01 mg/kg以下。由于气相色谱上农药的保留时间容易重叠，所以一次性测试数量较少，可依据需要配置数量合适的标液(例如十几种一组)对需要监控的农药进行专项测定。结合GC-MS法的后续确证，本前处理方法配合气相色谱适用于橄榄油样品中有机磷农药(GC-FPD)和有机氯、拟除虫菊酯类农药(GC-ECD)的测定。气相色谱测定的适用性结论仅作为本研究的附属，故不再作进一步技术参数考察。

图4 某进口初榨橄榄油样品的GC-FPD色谱图(检出倍硫磷)

2.5 气相色谱-质谱测定检出限、线性范围、回收率和精密度

按本方法对添加了313种农药混标的空白初榨橄榄油样品进行加标回收测定，以信噪比≥3确定方法检出限，甲胺磷、三唑醇检出限为0.03 mg/kg，乙酰甲胺磷、氧化乐果、环莠隆、苯嗪草酮、烯丙菊酯检出限为0.02 mg/kg，其余项目的检出限均可达到0.01 mg/kg。方法线性范围：0.01～0.5 mg/L，相关系数R2>0.99，在样品中添加0.01、0.05、0.20 mg/kg水平各农药标准品，按本方法进行加标回收试验(n=6)。三个水平回收率分布范围见表2。

表2 橄榄油样品在0.01、0.05、0.20 mg/kg水平加标的回收率分布范围(n=6)

如表2所示，3个水平加标的平均回收率共313×3-7=932个数据(7个项目检出限大于0.01 mg/kg，故其对应的0.01 mg/kg水平加标数据不参与统计)，采用分步回收率监控和基质匹配标准溶液对比响应值的办法[2]分析部分项目回收率偏差的原因：其中有一项农药平均回收率<50%，是百菌清，经查，发现导致百菌清回收率偏低的因素有：1)由于百菌清结构式中的甲腈基团与样品基质相互作用，导致提取效率偏低，这可以通过在提取液中加入少量磷酸来破坏这种作用力，可以提高提取率。通过使用不同样品基质验证该作用力的影响时，发现白萝卜样品基质体现最明显：在不使用磷酸来破坏这种作用力时，乙腈对百菌清的提取率<10%或提取不出来，加入少量磷酸其提取率可达70%以上。该现象也说明对于百菌清来说，不同样品基质的回收率参考意义不大。2)由于百菌清的易被吸附特点，对全程测试环境的洁净度要求较高，例如常在衬管和色谱柱柱头、柱尾等处发生吸附导致回收率偏低，若被吸附的是标液导致校准系列响应值偏低则出现回收率虚高的现象。所以一般百菌清的真实回收率能达到70%就属于较优结果，而通用性多残留方法中由于其前处理所用的石墨碳净化填料对百菌清的平面芳香环结构具有强吸附，难以洗脱，回收率不超过10%，故百菌清较难并入多残留分析方法。本实验将百菌清并入多残留分析方法，平均回收率44.3%，由于其精密度尚可接受(RSD<12.6%)，故未将其剔除。回收率介于50%～70%的项目主要有敌敌畏、联苯、茵草敌、五氯苯、六氯苯，由于这些农药的蒸气压较低，挥发性较强，在前处理浓缩时，一部分农药组分跟随溶剂挥发了。回收率介于120%～150%的项目主要有氟啶脲、噁唑磷、吡唑硫磷、茚虫威、丰索磷、噻唑磷、克螨特、氰戊菊酯、甲基对氧磷、对氧磷、噻螨酮，使用基质匹配标准溶液进行定量，农药项目的实际回收率均在110%以内，故该部分回收率的偏离应归因于基质增强效应[21-22]。由于目标物浓度的提高能减弱基质效应的影响，故加标水平为0.20 mg/kg的样品中，其回收率介于120%～150%的项目数量大幅减少。总体上看，回收率在70%～120%之间的项目占绝大多数(93.9%)，满足GB/T 27404—2008 《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，个别农药项目回收率不甚理想但对于多残留分析来说尚处于可接受范围，RSD<17.8%，结果满意。目前检测植物油中农药残留项目数最多的标准是SN/T 4428—2016《出口油料和植物油中多种农药残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》(77种农药)，该标准采用乙腈提取，分散固相萃取净化，液相色谱-串联质谱检测，相对来说，本法同时测定313种农药，速度更快，适用范围更广。后续试验采用本法对大豆油、花生油、葵花籽油进行测定，发现在气相色谱-质谱选择监测模式下，定量离子和定性离子的谱图和橄榄油的谱图区别不大，说明本法的净化方案亦适用于其他植物油的前处理净化。

2.6 实际样品分析

按本研究方法对34份进口初榨橄榄油进行检测，结果显示3份检出农药残留，其中一份检出倍硫磷0.032 mg/kg、腐霉利0.11 mg/kg。另外2份均检出腐霉利残留，检出值分别为0.064、0.15 mg/kg。其余样品中各项目均为未检出。

3 结论

本研究基于串联双柱净化方案建立了橄榄油中313种农药多残留检测的前处理方法，项目覆盖面广，操作快速，能有效去除油脂样品中大量干扰杂质。配合气相色谱和气质联用进行测定，所得GC-MS、GC-ECD、GC-FPD谱图均呈现良好的净化效果。同时，采用本方法对其他植物油(大豆油、花生油、葵花籽油)进行测定，亦获得满意的结果。