添加低剂量大豆卵磷脂稀释液低温保存绵羊精液的优化研究

2019-07-17赵建清高庆华

中国畜牧杂志 2019年7期

王杰，赵建清，李娜，芮雪，高庆华,3*

（1.新疆塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.新疆塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

用无动物源性成分替代稀释液中卵黄是近年的研究趋势[1-2]。植物性大豆卵磷脂具有制备简单、易于标准化操作、效果稳定等优点，已作为一种卵黄替代物，用于防止动物源性污染以确保生物安全[3-4]。卵黄中卵磷脂含量约为10%，TRIS 专利稀释液中卵黄含量约为23%，换算到稀释液中卵磷脂含量约为3%，本实验室以TRIS 专利稀释液卵黄中卵磷脂等量（3%）大豆卵磷脂替代卵黄，用1.25%～10%浓度大豆卵磷脂替代TRIS专利稀释液中卵黄设计试验，结果发现最低（1.25%）添加量低温保存效果最好且浓度越高保存效果越差，但未能确定添加1.25%以下浓度大豆卵磷脂是否具有更佳效果[5]。TRIS 稀释液制成粉剂后低温保存绵羊精液具有与TRIS 稀释液相同的效果[6]，但是大豆卵磷脂稀释液制成粉剂是否具有相同效果未可知。本实验拟用1.25%以下浓度的大豆卵磷脂替代卵黄稀释液中卵黄低温保存绵羊精液并将最优组制成粉剂，进一步探讨大豆卵磷脂稀释液及其粉剂对绵羊精液低温保存效果。

1 材料与方法

1.1 稀释液的制备将大豆卵磷脂加入去卵黄的主要成分包括TRIS、柠檬酸、果糖、ATP、维生素C、BSA、青链霉素的TRIS 专利稀释液基础液中混匀备用，稀释液粉剂采用真空冷冻干燥法制得。

TRIS 稀释液基础液配方：双蒸水136 g、果糖2 g、Tris 4.84 g、柠檬酸2 g、ATP 100 g、BSA 300 mg、维生素C 600 mg、青霉素40 万单位+链霉素20 万单位。

1.2 精液采集与保存挑选2～4 岁体况良好无繁殖障碍且经过调教的盘羊与巴士拜羊杂交公羊，实验前40 d补饲胡萝卜、鸡蛋，加强运动，实验前1 周排精检查。实验时观测精液色泽、气味、云雾状和射精量，2 位实验人员同时用细胞计数仪测定正常精液精子密度和活率，结果取两者观测平均值，只有向前推进运动率高于80%的精液用于实验，将精液稀释至约5×108/mL，水浴在冰箱中2 h 左右降温至0℃，并在冰水混合物中保存。

1.3 精液品质鉴定精子活率检测：将精液在冰箱内轻微混匀后，取5 μL 精液滴在载玻片上，盖上盖玻片，放在37℃热台上在400 倍显微镜下进行检测，2 位实验人员同时用10 分制观测，观测值相差1 分以内为有效数据，重复3 次，结果取平均值。

精子顶体完整率检测：吸取1 滴精液滴于载玻片的左端，用另一张边缘光滑的载玻片呈35°角自右面接触液滴，拉向另一侧，制成抹片，经自然风干5～10 min 后，用福尔马林磷酸盐固定液进行固定15 min，再经水洗干燥后，用姬姆萨染液对抹片精子进行染色90 min，再用蒸馏水冲洗、干燥，显微镜下观察顶体完整的精子数，重复3 次，结果取平均值。

1.4 实验设计

1.4.1 实验一实验一共分6 个组：0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%大豆卵磷脂组。挑选15 只公羊，将每只羊采集精液平均分为2 份后用6 组稀释液两两交叉稀释。重复3 次。将绵羊新鲜精液稀释后低温保存，在第0、1、4、7、10、12、18 天对精子活率、顶体完整率进行测定。

1.4.2 实验二在实验一选出的最优大豆卵磷脂浓度组后，将最优组（0.5%大豆卵磷脂组）和TRIS 卵黄稀释液经过干燥处理制成稀释液粉剂，避光保存30 d 后低温保存绵羊精液。挑选3 只公羊，将每只羊采集精液平均分为2 份，分别与最优粉剂组和TRIS 稀释液粉剂组等温混合。重复3 次。在保存第0、1、4、7、10、12天对精子活率和顶体完整率进行测定。

将最优粉剂组和TRIS 稀释液粉剂组低温保存第10天绵羊精液进行人工授精，40 d 后用B 超（GDF-K6）统计受胎率。选择无繁殖障碍、体况良好繁殖母羊240 只，任意一天用放栓器放入阴道海绵栓，放置12 d 后撤栓，撤栓时每只母羊肌肉注射330 单位孕马血清促性腺激素（PMSG），撤栓48 h 后经公羊试情，判定发情母羊间隔8～12 h 子宫颈外口输精2 次，每次输精0.4 mL，有效精子数达1×108个。

1.5 统计分析精子活率、顶体完整率用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析和多重比较，受胎率进行卡方检验，结果用平均值±标准差表示。P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 不同浓度大豆卵磷脂替代TRIS 稀释液中卵黄低温保存绵羊精液情况

2.1.1 大豆卵磷脂替代卵黄对绵羊精子活率的影响由表1 可知，保存第1 天开始0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%组精子活率高于0%组（P＜0.05），第10 天开始0%、0.25%组精子活率低于其他组（P＜0.05）。0.5%、0.75%、1.0%、1.25%组保存第10 天精子活率均大于50%，满足鲜精输精要求。0.5%组保存第18 天精子活率为18.6%，略高于0.75%组（P＞0.05），高于1.0%、1.25%组（P＜0.05）。

2.1.2 大豆卵磷脂替代卵黄对绵羊精子顶体完整率的影响由表2 可见，各组顶体完整率均随保存时间推迟逐渐降低，顶体完整率在各时间点均无显著差异，随着保存时间延长精子顶体损伤率逐渐增高。

表1 不同浓度大豆卵磷脂替代卵黄低温保存绵羊精子对精子活率的影响 %

表2 不同浓度大豆卵磷脂替代卵黄对低温保存绵羊精子顶体完整率的影响 %

表3 添加0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂及TRIS 粉剂对低温保存绵羊精子活率和顶体完整率的影响 %

2.2 稀释液粉剂低温保存绵羊精子对精子活率和顶体完整率的影响由表3 可知，添加0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂和TRIS 稀释液粉剂低温保存绵羊精液精子活率缓慢降低，自保存第1 天起0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂组精子活率均低于TRIS 稀释液粉剂组，但各时间点精子活率差异均不显著。保存第10 天2 组精子活率均大于50%，满足国家鲜精输精标准。2 种稀释液粉剂低温保存绵羊精子顶体完整率逐渐降低，0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂组顶体完整率第4～7 天小于TRIS 稀释液粉剂组，第10～12 天大于TRIS 稀释液粉剂组，但2 组稀释液粉剂顶体完整率在各时间点均无无统计学差异。

2.3 人工授精效果由表4 可见，0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂组受胎率65.49%，TRIS 稀释液粉剂组受胎率67.65%，2 组受胎率差别不显著且妊娠效果比较理想。

表4 添加0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂及TRIS 粉剂低温保存绵羊精液第10 天人工授精情况

3 讨论

3.1 不同浓度大豆卵磷脂替代稀释液中卵黄对绵羊精液低温保存的影响 TRIS 专利稀释液经过长期实践检验具有很好的应用效果，但是随着近年来对生物安全的重视以及对稀释液的研究，卵黄动物源性和成分不确定的问题已不能满足生产中的需求。Forouzanfar 等[7]用1%大豆卵磷脂冷冻保存绵羊精液，发现冷冻后精子活力、发育能力高于15%卵黄，证明了大豆卵磷脂替代稀释液中卵黄的可行性。本实验以0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%浓度大豆卵磷脂替代TRIS 专利稀释液中的卵黄，0.5%组大豆卵磷脂添加量低温保存绵羊精液效果最优，与孟娜娜等[8]0.375%添加量较为接近，本实验中保存第10 天的精子活率达到53.1%，顶体完整率达到较高水平，满足鲜精输精要求；0.5%组保存第18 天精子活率为18.6%，略高于0.75%组（14.3%），显著高于其他组，可能是随着大豆卵磷脂浓度增高，稀释液的粘稠度增高会影响精子活率[9]。0.5%大豆卵磷脂含量低于TRIS 稀释液卵黄中卵磷脂含量，但保存效果最优的原因可能是卵黄中不饱和脂肪酸含量比大豆卵磷脂低，而不饱和脂肪酸是卵磷脂中维持细胞结构最主要的成分[10]，卵黄内部成分对精子存活具有不利影响，降低精子保存时间[11]。0.5%、0.75%、1.0%、1.25%大豆卵磷脂添加组在前12 d 差别不大，都具有较好的保存效果。0%组未加入抗冷冻保护剂仍然具有一定的保存效果，保存12 d 精子活率仍能达到20.5%，可能是精清对维持精子活率具有一定的作用[12]。

3.2 稀释液粉剂对绵羊精液低温保存的影响稀释液粉剂的研究不仅克服了液体易变质、易损坏的弊端，明显地减轻体积和重量，更便于大批量运输和储存，使运输和储存费用大幅度下降[13]，也可以规范稀释液的生产流程，降低稀释液的保存条件，扩大稀释液的适用范围以及实现稀释液的商品化。本实验以0.5%大豆卵磷脂组和TRIS 专利稀释液制成粉剂保存绵羊精液，2 组在各时间点精子活率、顶体完整率差异均不显著，在保存10 d 时精子活率均高于50%，满足国家鲜精输精标准，且顶体完整率高于65%，与陈晓利等[14]使用TRIS 专利稀释液保存效果相同，可能是真空冷冻干燥对大豆卵磷脂稀释液粉剂中生物活性影响较小。大豆卵磷脂稀释液粉剂具有与卵黄稀释液相似的保存效果。

3.3 稀释液粉剂低温保存绵羊精液人工授精效果受胎率是检验精液及稀释液品质的最佳指标。本实验中，0.5%大豆卵磷脂稀释液粉剂和TRIS 专利稀释液粉剂2组受胎率无统计学差异，分别为65.49%和67.65%，略低于费俊阳等[15]70%的受胎率，但已达到鲜精输精受胎效果，鲜精输精受胎率为50%～80%[16]，可以进行规模化生产且具有理想的受胎效果，证明大豆卵磷脂稀释液粉剂能够用于绵羊精液低温保存。