海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌的多位点序列分型

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类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei,B.pseudomallei)是一种革兰阴性菌，通常在流行地区如东南亚和澳大利亚北部热带地区的土壤和水中分离[1-2]。B.pseudomallei可通过破损皮肤、消化道和呼吸道传播，经常接触该菌污染的土壤、水或者环境气溶胶[3-4]，可导致动物和人类类鼻疽病。类鼻疽的临床表现差异很大，可表现为无症状感染，局部皮肤脓肿，急性或慢性肺炎，关节感染或严重的全身败血症等[5]，其中感染性休克病例的死亡率高于90%[6]。B.pseudomallei作为类鼻疽的病原体，由于其非特异性临床表现，缺乏有效的疫苗，对多种抗生素耐药以及气溶胶传播的特性，再加上高死亡率等原因，已被美国疾病预防控制中心列为B类生物恐怖制剂和Ⅰ级病原微生物。

类鼻疽在海南全境均有发病，我们前期研究发现临床病例和环境菌株分布主要集中在沿海周边的地区，类鼻疽临床病例为全国之最[7-8]。自2003年以来，多位点序列分型(MLST)已广泛应用于B.pseudomallei的分子流行病学研究[9]。MLST数据库中显示了澳大利亚ST36和ST109以及泰国ST70和ST93的主导地位，但是关于海南省B.pseudomallei的STs报道信息较少，该菌的遗传多样性以及与国外地区菌株的分子遗传学关联并不清楚。本研究旨在对海南省B.pseudomallei临床及环境分离株的STs分析，为类鼻疽病高发地区的诊断和分子流行病学提供参考。

1 材料与方法

1.1菌株来源及培养 2017年12月至2018年5月从海南医学院附属海南省医院、海南医学院附属第一医院和三亚市人民医院收治的类鼻疽病患者中共获得16株B.pseudomallei临床菌株以及2株前期课题组采集的海南省环境分离株。将18株B.pseudomallei分别接种血平板和麦康凯平板, 置37 ℃培养观察菌落形态。

1.2MLST多位点序列 使用基因组提取试剂盒 (DNeasyBlood&Tissue Kit, Qiagen公司) 于二级生物安全实验室提取菌株染色体DNA, 操作步骤详见说明书。DNA经PCR检测鉴定为B.pseudomallei后[9]，置-20 ℃保藏备用，PCR扩增等位基因ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh[10]。扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,共循环35次；最终72 ℃延伸5 min。扩增产物取5 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物送生物公司测序。

1.3数据分析 对18株B.pseudomallei的MLST多位点序列测序结果进行分析，通过比较MLST网站(http://pubmlst.org/bpseudomallei/)的序列，确定了7个管家基因的等位基因数。7个数字由每个菌株的等位基因谱组成，并且每个不同的等位基因谱被指定为序列类型。根据序列类型，所有菌株的系统发育关系均使用eBURST v.3(eburst.mlst.net/v3/mlst_datasets/)生成，数据库B.pseudomallei的所有菌株的STs图表用JAVA v.8.0输出(https://java.com/en/download/faq/java8.XML)。

2 结 果

2.1菌株培养 18株B.pseudomallei在血平板上培养24 h后形成细小菌落, 48 h菌落生长至中等大小, 灰白色, 外形似车轮状或菊花样, 菌落周围呈半溶血状态, 生长菌落的平板有浓烈的土霉气味；在麦康凯平板上为分解乳糖的红色菌落。

2.2细菌多样性分析 细菌多样性分析18株B.pseudomallei属于12个不同的STs(表1)，其中本研究中发现一株B.pseudomallei的新STs为中国特有,由现有等位基因重配产生，数据提交后MLST网站将该基因型命名为ST1676。18株B.pseudomallei中ST50有4株，检出率占22.2%，ST58、ST232、ST1094各检出2株，其余ST各占1株。

在18个分离株中，ace，gltB，lepA，lipA和ndh基因只有2～3种变体，而narK和gmhD基因有5个种及以上的变体。除ST30、ST1090、ST1094和ST1676仅在中国报道之外，其他东南亚地区报道了剩余的8个ST，其中ST58、ST70、ST46在澳大利亚地区也报道过，不过澳大利亚地区报道的ST58和ST70可能是来自曾经到过亚洲的旅行者。

2.3系统发育分析 迄今为止，全世界已鉴定出约1 676种序列类型(STs)，这反映了该物种内的高度多样性。MLST数据库中，不同国家的ST分布显示了澳大利亚ST36和ST109以及泰国ST70和ST93的主导地位。使用eBURST将12个ST与MLST数据库中存在的所有ST进行比较，12个ST分布在eBURST图的几乎所有分支中，结果表明了海南省B.pseudomallei高度的多样性，见图1。

3 讨 论

B.pseudomallei是导致获得类鼻疽的主要病原体，在澳大利亚北部和东南亚地区广泛流行，中国南方是类鼻疽报道的高发区，特别是在海南省[11-12]。类鼻疽是一种潜在的致命疾病，感染病人死亡率为10%～50%[13]。大多数B.pseudomallei感染是从环境中获得的，如接触受污染的土壤或地表水，而人与人之间的传播非常罕见[13]。由于获得类鼻疽病的传播性质，加上B.pseudomallei受限制的环境传播模式，促进了具有有限地理分布的局部群体的遗传与进化[14-15]。

MLST是一种通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列，操作简单，结果能快速得到并且便于不同实验室的比较，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究[16]。MLST已成为一种既定的技术，可用于分离物的明确和精确表征以及流行病学研究。使用MLST的系统发育研究已经鉴定了对应于亚洲和澳大利亚的两种不同的B.pseudomallei群体[14-15, 17-18]。对菌群结构的分析促进了异常类鼻疽病病例的来源归因，特别是那些发生在类鼻疽病不流行的地区[19]。

表1 18株类鼻疽伯克霍尔德菌的多位点序列类型
Tab.1 Multilocus sequence typing of 18Burkholderiapseudomallei

菌株信息MLST编号来源acegltBgmhDlepAlipAnarKndhSTBp-1临床313314155Bp-3临床146154130Bp-5环境315114158Bp-7临床315114158Bp-9环境1213112911676Bp-13临床32341111090Bp-14临床3231131154Bp-15临床1131131689Bp-16临床122831931094Bp-17临床312114350Bp-18临床312114350Bp-19临床11281143232Bp-20临床122831931094Bp-21临床3411354670Bp-22临床11281143232Bp-23临床312113346Bp-24临床312114350Bp-25临床312114350

注：12个STs之间的相关性使用eBURST v3软件分析，下载B. pseudomallei所有的STs和等位基因图谱，将数据与本研究的12个ST的数据进行比较。本研究中的新型ST1676用绿色圆圈表示;11种已经报道过的STs用紫色圆圈表示；其余数据库中ST用黑色点表示。图1 类鼻疽伯克霍尔德菌株的多位点序列分布图Fig.1 Multilocus sequence typing map of Burkholderia pseudomallei

一些等位基因在我们的研究中占优势，特别是ace-3、gltB-1、lepA-1、lipA-1、narK-4，这些发现表示等位基因内的遗传多样性较低，但等位基因经常重组以形成新的ST。gmhD是7个管家基因中变异最大的，本研究中gmhD有7个单基因座变体，这可能表明gmhD突变在中国B.pseudomallei菌株的进化中的作用，这个等位基因的变异可能是菌株ST的高遗传多样性的原因。

总之，来自海南的18个分离株具有高度多样性。等位基因重组可能是导致这些多样性的重要因素，人类的迁移也可能影响整个海南的B.pseudomallei克隆的分布。B.pseudomallei在流行地区的广泛分布及其传播性，使得未来海南省可能出现更多的类鼻疽病例。我们的研究发现了中国菌株新的STs出现，需要进一步对这种相对罕见的感染性菌株进行分子流行病学研究。