微小RNA34a下调沉默信息调节因子1抑制内皮祖细胞功能的机制研究

马璐 王玉强 何青 杨秀红 李明 魏延津

261000 潍坊医学院(马璐、杨秀红)；276000 临沂市人民医院心内科(王玉强、魏延津)；266000 青岛大学(何青、李明)

1 材料与方法

1.1 材料

EGM-2培养基(包括EBM-2培养基和EGM-2MV Single Quots生长因子，FBS，hFGF-B，HYDROCORTISONE，R3-IGF-1，VEGF，hEGF，ASCORBIC ACID)购自美国Lonza公司；H2O2购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒、细胞凋亡试剂盒购自日本同仁公司；EndoFectinTM-Max转染试剂、qRT-PCR试剂盒购自GeneCopoeia公司；miR-34a mimics、miR-34a inhibitors及对照购自上海吉玛公司；SIRT1抗体购自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC分离培养和鉴定 选取年龄约25岁足月顺产健康产妇脐静脉血，采自临沂市人民医院产科，经过产妇及其家属、临沂市人民医院医学伦理委员会的同意。用密度梯度离心法从人脐血中提取内皮祖细胞。通过人脐血EPCs表面特异性抗原以及摄取乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素1，鉴定为EPC[5]。将细胞置于EGM-2培养基中，置于37 ℃、含5%CO2的培养箱内饱和湿度培养。待细胞生长融合约80%～90%，根据实验要求传代。

1.2.2 CCK-8检测细胞存活率 用3% H2O2与不含胎牛血清的培养基分别配制终浓度为0 μM、100 μM、200 μM、500 μM、800 μM的H2O2。将100 μl培养基中含2.0×105个细胞接种于96孔板中，并置于培养箱内孵育一段时间后，分别选取不同浓度的H2O2处理细胞24 h，用酶联免疫仪测定波长在450 nm处的吸光度值。重复三次实验，取平均值。

1.2.3 细胞转染 将对数生长期的细胞以2.0×105/孔的密度铺种于6孔板中，待细胞密度达到70%～80%时转染。转染时分miR-34a mimics组、miR-34a inhibitors组及各自对照组(mimics control、inhibitors control)。miR-34a mimic或inhibitor被转染至细胞以模拟过表达miR-34a或抑制miR-34a表达。整个转染过程按照EndoFectinTM-Max转染试剂说明操作。

1.2.4 qRT-PCR检测miR-34a的表达水平 转染24 h后用500 μM的H2O2处理细胞24 h。提取总RNA，将miRNA逆转录合成cDNA；以RNU6B作为内参基因，检测miR-34a的相对表达量。miRNA-34a及内参基因RNU6B的RT引物、特异性上、下游引物由GeneCopoeia公司合成。用RQ=2-ΔΔCt法计算miR-34a中miRNA的相对表达量。每个样本独立重复实验3次。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI 法检测细胞凋亡 2.0×105个细胞转染并用500 μM H2O2刺激，收集细胞后，胰酶消化制成单细胞悬液，分别加入 Annexin V，FITC 结合物及 PI Solution；离心后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测，重复3次，取平均值。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测SIRT1中mRNA的表达水平 按照1.2.4中方法检测SIRT1中mRNA的表达。以β-actin作为内参基因，检测SIRT1的相对表达量。内参β-actin、SIRT1上、下游特异性引物由上海生物工程公司合成。用RQ=2-ΔΔCt法计算SIRT1中mRNA的相对表达量。独立重复实验3次。

1.2.7 Western blot检测SIRT1中蛋白的表达 收集转染并用500 μM的H2O2处理24 h后的EPC，加入细胞裂解液充分裂解后提取细胞总蛋白。取等量的蛋白样品进行电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗置于摇床上室温孵育1 h，采用ECL化学发光试剂显色，用曝光系统检测目的蛋白，最后采用Image Lab软件进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 H2O2诱导EPC存活率

CCK-8检测发现，细胞存活率随着H2O2浓度增加而逐渐降低，呈现浓度依赖性。与不加H2O2相比，加入100 μM、200 μM、500 μM、800 μM的H2O2细胞存活率分别为94%±2%、85%±2%、78%±2%和32%±1%，差异有统计学意义(F=16.3，P<0.001)。

2.2 EPC的miR-34a表达水平

qRT-PCR检测转染效率，发现转染miR-34a mimics的细胞中miR-34a表达水平明显高于其对照组(t=16，P=0.003)，转染miR-34a inhibitors的细胞中miR-34a表达水平明显低于其对照组(t=53，P<0.001)。

2.3 miR-34a 对EPC凋亡影响

通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平，结果显示(图1)，miR-34a mimics组与其对照组相比，细胞凋亡率明显升高(t=30.4，P<0.001)；miR-34a inhibitors组与其对照组相比，细胞凋亡率明显降低(t=8.7，P<0.001)。

2.4 miR-34a在mRNA水平下调SIRT1

转染miR-34a并用H2O2刺激后，通过qRT-PCR技术检测EPCs中SIRT1的mRNA表达水平。结果显示，miR-34a mimics组中的靶基因SIRT1相对表达量低于其对照组(t=87.7，P<0.001)；miR-34a inhibitors组中的靶基因SIRT1相对表达量高于其对照组(t=125.0，P<0.001)。

2.5 miR-34a在蛋白水平下调SIRT1

通过Western blot技术检测miR-34a对靶基因SIRT1的蛋白表达水平。结果显示(图2)，miR-34a mimics组与其对照组相比较，SIRT1蛋白表达量明显下降(t=4.1，P= 0.014)；而miR-34a的inhibitors与其对照组相比，SIRT1蛋白表达明显增高(t=7.1，P=0.002)。

A：模拟物对照组，B：miR-34a模拟物组；C：抑制物对照组；D：miR-34a抑制物组；右下象限表示早期凋亡细胞，右上象限表示晚期凋亡和坏死的细胞图1 流式细胞术检测细胞凋亡率

图2 H2O2刺激下miR-34a对SIRTl中蛋白表达水平的影响

3 讨论

近年来，对EPC的功能调节一直是研究AS的热点和治疗靶点。研究发现，细胞内活性氧，尤其是H2O2，是一个重要的细胞内信号分子，通过对敏感性蛋白质半胱氨酸的巯基氧化修饰，调节转录因子活性和细胞信号转导，从而影响EPC功能[6]。

miRNA是一类高度保守的非编码内源性单链小RNA分子[7]。研究发现，AS发生发展过程中，miRNA表达失调，一些恶性生物学表型常和某种miRNA有着紧密联系[8-9]。miR-34a是一种具有多种功能的miRNA，在许多病理生理过程中都发挥着重要作用。因此，miR-34a在EPC损伤过程中具有重要作用。SIRT1是miR-34a作用的靶基因之一，在抑制EPC功能障碍中发挥着重要作用，它与细胞分化、衰老、增殖与凋亡密切相关，在延长生物寿命及延缓多种与年龄相关疾病的发展有重要作用[10]。研究表明，SIRT1与多种细胞功能的调节有关，包括AS发展[11]。

在本实验研究中，利用H2O2建立一个氧化应激的模型，在随着H2O2的浓度增加时，会逐渐降低EPCs存活率，800 μM的H2O2诱导时仅有32%的EPC存在；当H2O2的浓度为500 μM，有着较高生存的细胞，能够作为在氧化应激的状态下损伤细胞，这就对我们以后在延缓EPC功能损伤及障碍产生重要理论指导和临床意义。

通过脂质体转染将miR-34a转染到EPCs中，H2O2刺激后RT-PCR的反应，转染miR-34a mimics，miR-34a的表达水平明显升高，而转染miR-34a inhibitors时miR-34a表达水平明显下降。因此，miR-34a在EPCs功能调节控制中是一个关键靶点。RT-PCR和Western blot检测发现，氧化应激状态下，miR-34a过表达时其靶基因SIRT1在mRNA及蛋白水平均降低，而抑制miR-34a的表达时，其靶基因SIRT1在mRNA及蛋白水平表达均明显升高。因此，miR-34a增加与SIRT1减少之间可能存在直接因果关系。

综上所述，氧化应激状态下可使miR-34a的过表达或抑制，改变 SIRT1中蛋白的表达，表明miR-34a是AS的一种促使基因，可作为治疗AS新的靶点。

利益冲突：无