血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性与冠心病的关系

王玉 于雪 张闻多 王欣越 杨睿悦 王思明 曾洁 唐月明 栗向辉 李红霞 陈文祥 董军 季福绥

100730 北京医院生物化学与分子生物室，国家老年医学中心(王玉、杨睿悦、王思明、唐月明、粟向辉、李红霞、董军)，心内科(于雪、张闻多、王欣越、季福绥)；100730 北京，卫生部临床检验中心(曾洁、陈文祥)

研究发现，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)降低是冠心病(coronary atherosclerosis heart disease，CAD)的独立危险因素之一[1]。然而，临床研究中，具有升高HDL-C作用的胆固醇酯转移蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)抑制剂未取得预期效果[2-3]。卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin：cholesterol acyltransferase，LCAT，EC 2.3.1.43)是胆固醇逆向转运过程中的关键酶[4-5]，曾被认为是HDL发挥CAD保护作用的重要因素。但由于缺乏简便、可靠的LCAT活性测定方法，LCAT活性与冠心病的关系仍无定论。我们建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)测定LCAT活性的方法，与传统的同位素示踪法相比，安全、简便、精密，可准确评估人群中LCAT的活性。本研究采用HPLC法测定行冠状动脉造影患者血清的LCAT活性，分析LCAT活性与CAD及其危险因素的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

本研究为病例对照研究。纳入2014年11月至2015年8月在北京医院行冠状动脉造影的425例患者，年龄17～91岁，男性291例(58.2%)，女性209例(41.8%)。根据冠状动脉造影结果分为CAD组(341例)和非CAD组(84例)。CAD定义为冠状动脉造影显示左前降支、左回旋支、右冠状动脉及其主要分支中至少有一支血管管腔狭窄程度≥50%[6]；非CAD患者定义为上述血管管腔狭窄程度<50%。收集患者的既往史、个人史、家族史、血压、血脂和血糖等临床资料。本研究符合医学伦理学要求，已通过北京医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

采集血液样本后，1 h内分离血清后分装，-80℃冰冻保存待测。测定时将血清样本融化并使之恢复到室温，摇匀，采用HPLC测定血清LCAT活性。每次重复测定25～30个样本、2个质控血清，共进行18次，完成全部样本的测定。将-80℃冻存的脂质体、血清和质控血清取出，平衡至室温。用加样器吸取500 μl的脂质体至冰水浴中的预冷的试管中，再用加样器精密吸取10 μl血清或质控样本于脂质体中，37℃温育1 h； 温育结束后将试管置于冰水浴中并加入500 μl乙醇终止反应，加入正己烷1 ml，涡旋震荡20 min抽提脂质；转移正己烷层500 μl至HPLC样瓶，减压干燥，用200 μl的流动相重组，混匀后进行HPLC分析。本研究使用的仪器包括Agilent 1200高效液相色谱仪(Agilent公司，美国)；Nova-Pak C18色谱柱(5 μm，3.9 mm×150 mm，Waters公司，美国)；有机溶剂乙腈、异丙醇、正己烷、无水乙醇等为HPLC级(Fisher Scientific公司，美国)，以及其他试剂，如甲醇、氯仿、磷酸盐(北京化学试剂公司)。

血清样本的常规生化指标，如血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、随机血糖(glucose，GLU)等采用酶法测定；HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)采用匀相法测定；ApoAI、ApoB采用免疫比浊法。所有试剂均为Roche公司产品(瑞士)，按试剂盒说明书于自动生化分析仪(日立7180，日本)测定。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组的一般资料比较

CAD组中LCAT活性显著高于非CAD组，而男性为(37.3±8.4)nKat/L，女性(36.0±6.8)nKat/L，差异无统计学意义(P>0.05)。此外，两组的HDL-C、ApoAI和随机血糖等均有显著差异(均为P<0.05)，见表1。

2.2 血清LCAT与CAD危险因素的相关性

Spearman相关性分析结果显示，LCAT活性与BMI(r=0.09)、TG(r=0.30)、ApoB(r=0.22)和随机血糖(r=0.09)呈正相关；与HDL-C (r=-0.26)呈负相关，见表2。

2.3 单因素和多因素logistic回归分析

单因素logistic回归分析结果显示，LCAT活性升高是CAD危险因素(OR=3.11，95%CI：1.40～6.91，P=0.005)，在校正年龄、性别、HDL-C、ApoAI、随机血糖等危险因素后，多因素logistic回归分析发现LCAT的活性升高仍是CAD危险因素(OR=3.28，95%CI：1.27～8.50，P=0.014)。

3 讨论

早期研究认为，LCAT活性升高是CAD的保护因素。Sethi等[7]采用外源底物法测定缺血性心脏病和正常对照组人群血清的LCAT活性，去除年龄和性别因素后发现，CAD患者的LCAT活性明显降低，LCAT活性是CAD的保护性因素。然而，既往研究先后采用内/外源底物法，测定样本血清LCAT活性[6，8-9]，发现LCAT活性与TC、TG、ApoB等CAD危险因素正相关，且CAD组的LCAT活性较对照组高(P=0.027)，故LCAT活性可作为AS亚临床诊断和预测的标志物。但是，既往研究中LCAT活性测定方法复杂多样。其中，内源底物法受血清脂质组成的影响，不能反映血清LCAT的真实活性[10-11]；外源底物法设计各异[12-14]，去除底物和内源脂质影响的程度不同，且脂质体制备复杂，不同方法测定的LCAT活性可能具有不同的生物学意义，导致结果缺乏可比性。针对以上各种问题，我们建立了一种简便、精密、可靠的HPLC测定人血清LCAT活性的方法[15]，且基本不受内/外源底物和物质的影响，适用于高通量临床应用。

表1 两组的LCAT活性与其他参数的差异

表2 LCAT活性与CAD危险因素的相关性分析

LCAT活性与CAD的关系仍有争议。近期研究发现，LCAT与多种CAD危险因素相关，LCAT可能促进CAD的发生，是CAD的危险因素。但是，多数研究仅评估LCAT活性与CAD危险因素或颈动脉内膜中层厚度的关系，较少有大规模研究评估LCAT活性与CAD的关系。与既往研究结果相似，本研究发现，CAD患者的LCAT活性显著增高，且LCAT活性与BMI(r=0.09)、TG(r=0.30)、ApoB(r=0.22)和随机血糖(r=0.09)正相关；与HDL-C(r=-0.26)负相关。校正年龄、性别、HDL-C、ApoAI和血糖等因素后，多因素logistic回归分析提示LCAT活性升高仍是CAD的独立危险因素。然而，部分研究发现，LCAT活性与HDL-C正相关。但既往研究样本量较小，LCAT与CAD的关系仍需更多研究证实。

本研究有一些局限性，包括对照组为冠脉狭窄<50%的患者而非冠状动脉正常人群，而此类患者可能存在动脉粥样硬化或为冠心病的高危人群，因此会低估病例/对照组间的差异，对结果造成一定的偏倚。此外，样本量较小，难以进一步探讨LCAT活性与冠心病严重程度的相关性。

综上所述，本研究揭示了LCAT活性升高与多种CAD危险因素相关，是CAD的独立危险因素，但仍需更多研究证实。

利益冲突：无