莲子与姜辣素组合物抗癌及止吐减毒增效作用研究

龙腾腾 ，赵成健，江海洋，李晓玲*，岳旺

本研究创新点：

首次将姜和莲子作为对药进行抗呕吐研究，二者均为食用原料，经济实惠、无毒副作用，且联合抗癌止吐效果良好，为一种减少呕吐反应的天然药物组合物，为开发抗癌、止吐减毒增效的辅助抗癌用药提供了实验基础和理论依据。

本研究不足之处：

本研究从药理学研究莲子与姜辣素组合物（简称莲姜组合物）的抗呕吐作用，并未在分子水平探究其分子靶点及机制，有待进一步研究。

呕吐是临床多种疾病，如消化道疾病、晕动病、眩晕症、脑病等常见并发症状，同时也是术后、癌症放化疗后及妊娠等的常见症状，可引起水电解质紊乱［1-2］。化疗药物毒副作用最痛苦的症状之一即是呕吐，而传统抗呕吐药对癌症放化疗后呕吐的疗效差，且常需联合用药。化学制剂止吐药5-羟色胺3（5-HT3）受体拮抗剂和神经激肽1（NK1）受体拮抗剂等适于放化疗后的呕吐治疗，但仍存在作用靶点单一、不良反应大的问题。因此，寻找天然、低毒、广谱的止吐药物成为亟待解决的问题。

姜作为中药和调味料已有两千年应用史，孙思邈《备急千金要方·卷十六呕吐哕逆》记载“凡呕者多食生姜，此是呕家圣药”，姜辣素是生姜中活性成分，是一种天然、低毒的止吐药，但在癌症化疗中的止吐效果仍不理想，前期研究表明采用对药方式可取得较好疗效［3］。莲子为莲科植物莲的干燥成熟果实，味甘淡微涩，是民间食用原料，已有抗癌和止吐作用的报道［4-5］，但未见姜和莲子作为对药的研究，本研究利用小鼠模型及新型较理想的水貂呕吐动物模型将莲子与姜辣素作为对药研究其抗癌、止吐减毒增效作用，旨在为临床提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠96只，雄性，SPF级，体质量17～19 g，由青岛市实验动物中心提供。24 h 自然光照射，实验前自由饮食饮水。

健康成年黑色水貂72只，雄性，CL级，体质量（1.5±0.2）kg，由青岛市特种动物饲养中心提供。将其单只置于75 cm×50 cm×50 cm铁笼内饲养。

1.1.2 实验药物 顺铂（山东齐鲁制药有限公司，批号1303018）；盐酸昂丹司琼注射液（山东齐鲁制药有限公司，批号1210041）；阿扑吗啡（Sigma，批号0202151）；注射用环磷酰胺（江苏恒瑞药业股份有限公司，批号12010625）；硫酸铜（沈阳远东试剂厂，批号20060606）；生姜（购自山东省平度市）。

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1.2 实验时间 2017年。

1.3 实验方法

1.3.1 莲子与姜辣素组合物（以下简称莲姜组合物）对小鼠S180肉瘤的影响 按照本课题组之前的方法［6］，抽取S180肉瘤细胞（传代5～7 d）生长良好的乳白色的腹腔积液，以适量无菌0.9%氯化钠溶液稀释成瘤细胞悬液，细胞数为107/ml，每只小鼠右腋窝皮下接种0.2 ml（含瘤细胞2×106个）。接种次日将小鼠随机分4组，每组12只。正常对照组给予蒸馏水0.5 ml灌胃；环磷酰胺组给予环磷酰胺20 g/kg腹腔注射；姜辣素组给予姜辣素10 g/kg（相当于含生药量）灌胃；莲姜组合物组给予莲姜组合物10 g/kg（相当于含生药量）灌胃。连续给药10 d，期间常规饲养、饮水，食物不限。

停药次日，小鼠全部脱颈椎处死，剥取皮下实体瘤瘤块，称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率（%）=〔对照组平均瘤重（C）-实验组平均瘤重（T）〕/对照组平均瘤重（C）×100%。

1.3.2 莲姜组合物对小鼠艾氏腹水瘤的影响 细胞接种、分组、剂量、给药方式、实验时间与S180肉瘤相同。并按1.3.1中肿瘤抑制率计算方法计算艾氏腹水瘤抑制率。

1.3.3 姜辣素与莲姜组合物的制备及分组 姜辣素与莲姜组合物的制备按本课题组之前的方法制备［7］。先将72只水貂随机分为3组，分别用于研究莲姜组合物对顺铂（顺铂呕吐组）、阿扑吗啡（阿扑吗啡呕吐组）、硫酸铜（硫酸铜呕吐组）3种药物引起的呕吐的影响，每组24只；再将顺铂呕吐组水貂随机分为正常对照、阳性对照、姜辣素、莲姜组合物亚组，即正常对照亚组1、阳性对照亚组1、姜辣素亚组1、莲姜组合物亚组1，每组6只；阿扑吗啡呕吐组、硫酸铜呕吐组的亚组分组同上，每个亚组6只。

1.3.3.1 莲姜组合物对顺铂引起的呕吐的影响 正常对照亚组1给予5 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃；阳性对照亚组1给予盐酸昂丹司琼注射液2 mg/kg腹腔注射；姜辣素亚组1给予姜辣素10 g/kg（相当于含生药量）灌胃；莲姜组合物亚组1给予莲姜组合物10 g/kg（相当于含生药量）灌胃。依据本课题组之前的方法［8］，给药30 min后，各亚组动物给予0.375%顺铂7.5 mg/kg腹腔注射，观察水貂在给药后6 h内的呕吐反应，记录呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数。

1.3.3.2 莲姜组合物对阿扑吗啡引起的呕吐的影响 正常对照亚组2、阳性对照亚组2、姜辣素亚组2、莲姜组合物亚组2给药方法同上，给药30 min后，各亚组动物给予0.08%阿扑吗啡1.6 mg/kg腹腔注射，观察水貂在给药后6 h内的呕吐反应，记录呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常对照组、环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠S180肉瘤肿瘤质量比较及肿瘤抑制率 4组小鼠S180肉瘤肿瘤质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠S180肉瘤肿瘤质量轻于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠S180肉瘤肿瘤抑制率分别为65.5%、31.9%、53.4%。

表1 正常对照组、环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠S180肉瘤肿瘤质量比较（±s，g）Table 1 Comparison of tumor mass among four groups of mice （S180 sarcoma model）

表1 正常对照组、环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠S180肉瘤肿瘤质量比较（±s，g）Table 1 Comparison of tumor mass among four groups of mice （S180 sarcoma model）

注：a为正常对照组小鼠于灌胃第2天因灌胃不当呛死2只；b为莲姜组合物组小鼠于灌胃第2天因灌胃不当呛死1只；与正常对照组比较，cP＜0.05

组别 只数 肿瘤质量正常对照组a 10 3.91±1.83环磷酰胺组 12 1.35±1.69c姜辣素组 12 2.66±2.23c莲姜组合物组b 11 1.82±1.51c F值 3.956 P值 0.014

2.2 正常对照组、环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠艾氏腹水瘤肿瘤质量比较及肿瘤抑制率 4组小鼠艾氏腹水瘤肿瘤质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠艾氏腹水瘤肿瘤质量轻于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠艾氏腹水瘤肿瘤抑制率分别为64.7%、26.7%、54.5%。

2.3 顺铂呕吐组中4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较 顺铂呕吐组中，4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中阳性对照亚组1、姜辣素亚组1、莲姜组合物亚组1水貂呕吐潜伏期长于正常对照亚组1，干呕次数、呕吐次数少于正常对照亚组1，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.4 阿扑吗啡呕吐组中4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较 阿扑吗啡呕吐组中，4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中阳性对照亚组2、姜辣素亚组2、莲姜组合物亚组2水貂呕吐潜伏期长于正常对照亚组2，干呕次数、呕吐次数少于正常对照亚组2，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

2.5 硫酸铜呕吐组中4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较 硫酸铜呕吐组中，4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中阳性对照亚组3、姜辣素亚组3、莲姜组合物亚组3水貂呕吐潜伏期长于正常对照亚组3，干呕次数、呕吐次数少于正常对照亚组3，差异有统计学意义（P＜0.05，见表5）。

表2 正常对照组、环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠艾氏腹水瘤肿瘤质量比较（±s，g）Table 2 Comparison of tumor mass among four groups of mice （EAC tumor model）

表2 正常对照组、环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠艾氏腹水瘤肿瘤质量比较（±s，g）Table 2 Comparison of tumor mass among four groups of mice （EAC tumor model）

组别 只数 肿瘤质量正常对照组a 10 3.41±1.50环磷酰胺组 12 1.21±0.47c姜辣素组 12 2.50±1.09c莲姜组合物组b 11 1.55±1.25c F值 7.927 P值 ＜0.001

表3 顺铂呕吐组中4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较Table 3 Comparisons of vomiting incidence，vomiting latency，retching and vomiting frequencies among four groups of minks （cisplatin model）

表4 阿扑吗啡呕吐组中4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较Table 4 Comparisons of vomiting incidence，vomiting latency，retching and vomiting frequencies among four groups of minks （apomorphine model）

表5 硫酸铜呕吐组中4个亚组水貂呕吐发生率、呕吐潜伏期、干呕次数、呕吐次数比较Table 5 Comparisons of vomiting incidence，vomiting latency，retching and vomiting frequencies among four groups of minks （copper sulfate model）

3 讨论

肿瘤放化疗性呕吐是临床最常见的毒副作用，不仅可造成患者电解质紊乱或营养不良，还可因剧烈呕吐而使患者放弃治疗，因此抑制放化疗呕吐毒副作用亟待解决。顺铂是癌化疗经典药物，可直接和间接刺激外周与中枢5-HT3受体引起呕吐，可作为5-HT3受体激动剂的呕吐动物模型；阿扑吗啡可刺激中枢多巴胺受体引起呕吐；硫酸铜可通过外周刺激引起呕吐。水貂（mink）为新型动物呕吐模型，研究表明硫酸铜、阿扑吗啡、顺铂和X射线均可诱发水貂产生恶心、干呕与呕吐，其表现与国际理想的呕吐动物模型——同类鼬科动物雪貂（ferret）相似，测定指标如干呕、呕吐次数也与雪貂相近［8］。本研究采用顺铂、阿扑吗啡、硫酸铜3种水貂呕吐动物模型，研究莲子与生姜提取物姜辣素制得的组合物（莲姜组合物）的抗癌活性及其对癌化疗后呕吐毒副作用的影响，旨在创制一种天然、低毒、高效、广谱的止吐新药。

莲子是睡莲科水生草本植物荷花的种子。我国大部分地区均有产出，秋、冬季果实成熟。《本草纲目》中记载“莲之味甘，气温而性涩，清芳之气，得稼墙之味，乃脾之果也。”《妇人良方》中记载莲子可治呕吐不食。中药姜被誉为“呕吐圣药”。姜辣素是从生姜中提取的活性成分，前期实验证明姜辣素能够对抗无机及有机毒物硫酸铜和顺铂所致呕吐，抑制肠道嗜铬细胞释放致吐因子5-HT3和P物质，作用于化疗呕吐最相关的NK1和5-HT3等受体，是多靶点、天然、低毒止吐药［9-12］。

本研究采用抗肿瘤药物的常用模型小鼠S180肉瘤和艾氏腹水瘤观察莲姜组合物的作用。莲子和生姜的抗癌作用已有报道［13］。本研究结果显示，环磷酰胺组、姜辣素组、莲姜组合物组小鼠S180肉瘤、艾氏腹水瘤肿瘤质量轻于正常对照组，表明莲姜组合物有抗癌作用。

单一止吐药疗效不理想，前期研究表明采用对药方式可取得较好疗效［14］。本研究结果显示，3种呕吐动物模型均显示莲姜组合物具有抗呕吐作用，说明该组合物抗呕吐谱广，可用于各类呕吐，为其他类型的中枢、外周性呕吐（如海洋性呕吐、妊娠呕吐等）研究提供了理论依据。但该组合物对NK1、5-HT3和大麻受体的胞内机制尚待深入研究。

综上所述，莲姜组合物有抗癌及止吐减毒增效作用，为创制天然、低毒、多靶点的药食同源的抗癌、止吐减毒增效剂提供了实验基础和理论依据。

作者贡献：岳旺进行文章的构思与设计；龙腾腾负责研究的实施与可行性分析，撰写论文，负责文章的质量控制及审校；江海洋负责数据的收集、整理及统计学处理；赵成健负责结果分析与解释；李晓玲进行论文修订，英文的修订，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。