玉屏风口服液对变应性鼻炎小鼠水通道蛋白5表达的影响

赵梅珍

【摘要】 目的 研究玉屏風口服液对变应性鼻炎（AR）小鼠鼻腔炎症及水通道蛋白5（AQP5）表达的影响。方法 30只雌性BALB/c小鼠， 随机分为对照组、鼻炎组和玉屏风口服液组， 各10只。除对照组外， 其他两组腹腔注射卵清蛋白（OVA）与氢氧化铝[Al（OH）3]配制的致敏液及OVA滴鼻建立AR小鼠模型。对照组、鼻炎组生理盐水0.2 ml灌胃， 玉屏风口服液组玉屏风口服液2.0 ml/kg灌胃， 35 d后， 比较三组症状评分、血清卵清蛋白特异性IgE（OVA sIgE）和白细胞介素4（IL-4）含量、鼻黏膜病理学改变、AQP5 mRNA和蛋白含量。结果 鼻炎组行为学积分为（7.3±0.5）分， 对照组行为学积分为（1.8±0.3）分， 玉屏风口服液组行为学积分为（2.0±0.2）分。对照组和玉屏风口服液组比较差异无统计学意义（P>0.05）;两组积分均显著低于鼻炎组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。鼻炎组、对照组和玉屏风口服液组血清OVA sIgE含量分别为（1.81±0.32）、（0.25±0.14）、（0.28±0.10）μg/μl。鼻炎组、对照组和玉屏风口服液组IL-4含量分别为（20.10±2.30）、（6.50±1.30）、（6.70±1.50）pg/ml。对照组与玉屏风口服液组的血清OVA sIgE含量及IL-4含量比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）;鼻炎组的血清OVA sIgE含量及IL-4含量均高于对照组与玉屏风口服液组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。鼻黏膜AQP5 mRNA的相对表达量用β-actin校正， 对照组表达量设为1， 玉屏风口服液组和鼻炎组分别为对照组的3倍和173倍。玉屏风口服液组和对照组比较， 差异无统计学意义（P>0.05）;鼻炎组显著高于玉屏风口服液组和对照组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。对照组、玉屏风口服液组和鼻炎组AQP5蛋白含量分别为（0.17±0.03）、（0.18±0.01）、（0.53±0.02）ng/ml。玉屏风口服液组和对照组比较， 差异无统计学意义（P>0.05）;鼻炎组显著高于玉屏风口服液组和对照组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 玉屏风口服液可减轻AR小鼠鼻黏膜炎症， 降低细胞因子分泌和AQP5表达， 减轻鼻黏膜细胞的受损程度， 对AR小鼠鼻黏膜有保护作用。

【关键词】 玉屏风口服液;变应性鼻炎;水通道蛋白5

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.18.112

变应性鼻炎（allergicrhinitis， AR）指接触变应原后， 免疫球蛋白E（IgE）介导的介质释放， 多种免疫细胞、细胞因子等参与的鼻黏膜非感染性炎性疾病。其发病率高达10%～40%且逐年上升， 严重影响患者生活和工作， 给社会、家庭带来巨大经济负担[1]。其发病机制尚不明确。玉屏风口服液的主要成分为黄芪、防风、白术（炒）， 黄芪和白术均能抗炎及提高机体免疫力[2]， 其抑制IgE产生和抗炎性介质及中和变应原， 其抗过敏作用确切[3]。本实验通过观察其对水通道蛋白5 （aquaporin5， AQP5）表达水平的影响， 研究AR发病机制， 探讨其对AR的治疗作用。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 广东省实验动物中心购BALB/c小鼠30只， 雌性， SPF级， 6～8周龄， 20 g/只。饲养1周。随机分为对照组、鼻炎组和玉屏风口服液组， 每组10只。

1. 2 试剂 OVA（A5503， Sigma）， 玉屏风口服液（湖北东信药业有限公司）， Mouse OVA-sIgE ELISA Kit （武汉华美）， Mouse IL-4 Quantikine ELISA Kit（R&D）， Anti-Aquaporin 5 antibody（AB78486， Abcam）， PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A， takara）， SYBR Premix Ex TaqⅡ（RR820A， takara）， 细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0027， 碧云天）。

1. 3 致敏、激发和给药 20 μg OVA与2 mg Al（OH）3溶于100 μl生理盐水， 鼻炎组1、7、14、21 d腹腔注射， 对照组采用生理盐水;鼻炎组和玉屏风口服液组小鼠两侧鼻腔各滴10 μl 10%OVA， 28～35 d， 对照组采用生理盐水;对照组、鼻炎组采用生理盐水0.2 ml灌胃， 玉屏风口服液组采用玉屏风口服液2.0 ml/kg灌胃， 均从致敏第1天开始， 致敏前1 h给药， 35 d。

1. 4 项目观察和检测方法

1. 4. 1 症状学观察 最后一次滴鼻24 h内， 三组用OVA各滴鼻1次， 观察每只小鼠30 min， 记录其喷嚏、搔鼻和鼻涕量。喷嚏1～3次/轻擦鼻数次/少量鼻涕各1分， 喷嚏4～10次/

摩擦两鼻孔间/鼻涕较前增加各2分， 喷嚏>11次/摩擦鼻周四处/涕流满面各3分。总分>5分示造模成功。

1. 4. 2 血清OVA sIgE和IL-4含量 最后一次滴鼻24 h后， 摘眼球取血， 3000 r/min， 收集血清。酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测血清OVA sIgE和IL-4含量， 酶标仪（品牌：Melecullar Devices， 型号：PARADIGM）检测采集数据。

1. 4. 3 鼻黏膜病理学改变 最后一次滴鼻24 h后断颈处死小鼠， 取鼻中隔黏膜， HE染色， 用荧光倒置相差显微镜观察中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等浸润情况。

1. 4. 4 检测AQP5 mRNA含量 常规Trizol法提取总RNA。据PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书将2 μg RNA反转录为cDNA。引物序列：AQP5 正向：5-GGC CAC ATC AAT CCG GCC ATT A-3， 反向：5-GGC TGT TCC ATG AAC CCA GCC-3;β-actin 正向：5-TGC TGT CCC TGT ATG CCT CT-3， 反向：5-TTG ATG TCA CGC ACG ATT TC-3。

据SYBR Premix Ex TaqⅡ说明书， 用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI， 7500Fast）扩增。

1. 4. 5 Western blot检测AQP5蛋白含量 试剂盒提取鼻黏膜AQP5蛋白， 常规WB进行SDS-PAGE电泳， 凝胶成像分析系统和IPP6.0图像分析软件拍照和分析条带灰度值。

1. 5 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 症状评分 鼻炎组：行为学积分（7.3±0.5）分， 模型成功。对照组和玉屏风口服液组：行为学积分分别为（1.8±0.3）分和（2.0±0.2）分， 模型未成功， 两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;两组积分均显著低于鼻炎组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。

2. 2 血清OVA sIgE和IL-4含量 鼻炎组、对照组和玉屏风口服液组血清OVA sIgE含量分别为（1.81±0.32）、（0.25±0.14）、（0.28±0.10）μg/μl。鼻炎组、对照组和玉屏风口服液组IL-4含量分别为（20.10±2.30）、（6.50±1.30）、（6.70±1.50）pg/ml。对照组与玉屏风口服液组的血清OVA sIgE含量及IL-4含量比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）;鼻炎组的血清OVA sIgE含量及IL-4含量均高于对照组与玉屏风口服液组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。

2. 3 鼻黏膜病理学改变 鼻炎组鼻黏膜不完整， 组织间质水肿明显， 小血管扩张， 大量嗜酸性细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润;对照组与玉屏风口服液组均鼻黏膜上皮完好， 组织间隙无明显水肿、血管未见扩张， 仅见少量淋巴细胞、中性粒细胞浸润。

2. 4 鼻黏膜AQP5 mRNA含量 鼻黏膜AQP5 mRNA的相对表达量用β-actin校正， 对照组表达量设为1， 玉屏风口服液组和鼻炎组分别为对照组的3倍和173倍。玉屏风口服液组和对照组比较， 差异无统计学意义（P>0.05）;鼻炎组显著高于玉屏风口服液组和对照组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。

2. 5 Western blot检测AQP5蛋白含量 对照组、玉屏风口服液组和鼻炎组AQP5蛋白含量分别为（0.17±0.03）、（0.18±0.01）、（0.53±0.02）ng/ml。玉屏风口服液组和对照组比较， 差异无统计学意义（P>0.05）;鼻炎组显著高于玉屏风口服液组和对照组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。

3 讨论

随着社会工业化发展， AR发病率逐年增高， 严重影响患者生活、健康和工作[4]。流涕过多是AR的主要症状之一， 如何有效改善及研究其机制是关注的重点。AQP5在维持鼻腔液体平衡中的作用最重要， 主要分布在小鼠鼻黏膜纤毛柱状上皮细胞、腺上皮细胞和内皮细胞[5]。中医将AR归为“鼻鼽”病[6]， 主要是肺阳不足且风邪入侵致肺气受阻[7]。黄芪益气固表、实卫止汗;白术健脾益气;防风祛风解表。玉屏风口服液可固表止汗、补气虚、固表虚、增强人体抵抗外邪的能力且具有抗炎的药理作用。

本研究结果表明， 玉屏风口服液显著降低血清OVA sIgE和IL-4含量及小鼠鼻黏膜AQP5表达， 减轻组织间质水肿、小血管扩张及炎症细胞的浸润。

综上所述， 玉屏风口服液可改善流涕等症状， 有效改善通气功能及炎性因子反应， 为改善AR提供理论依据。

参考文献

[1] Brozek JL， Bousquet J， Agache I， et al. allergic rhinitis and its impact onasthma（ARIA） guidelines-2016 revision. J Allergy Clin Immunol， 2017， 140（4）：950-958.

[2] 肖新云， 赵先平， 唐标， 等. 七味白术散对菌群失调腹泻小鼠血常规的影响. 微生物学通报， 2015， 42（2）：325-331.

[3] 舒维萍. 人参五味子汤加减治疗小儿哮喘缓解期的效果分析. 湖南中医药大学学报， 2016， 36（A02）：964.

[4] Cagnani CE， Sole D， Diaz SN， et al. Allergic rhinitis update and its impact on asthma （ARIA 2008）. Latin American perspective. Revista Alergia Mexico， 2009， 56（2）：56-63.

[5] Lei F， Zhao XD， Zhu JG， et al. Expression and its significance of aquaporin 5 in rat nasal mucosa of experimental allergic rhinitis. Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， 2005， 40（3）：172-175.

[6] 钱雅琴， 朱玲， 吴飞虎. 复方辛夷滴鼻液鼻腔冲洗治疗变应性鼻炎疗效观察及对鼻腔分泌物嗜酸性粒细胞的影响. 中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志， 2018， 26（3）：198-202.

[7] 張朝梅， 陈雪梅. 柴胡桂枝汤联合西替利嗪治疗过敏性鼻炎的疗效及对炎性细胞因子的影响. 世界中医药， 2017， 12（9）：2065-2068.

[收稿日期：2019-04-02]