成都平原蚕豆高效根瘤菌的筛选及其促生功能初步评价

2019-07-13全紫曼陈远学徐开未

植物营养与肥料学报 2019年6期

全紫曼，陈远学，刘明，彭丹，蒋帆，周元，邹兰，徐开未

（四川农业大学资源学院，四川成都 611130）

中国是最大的蚕豆生产国，干蚕豆产量占世界总产的36.7%[1]，是我国传统对外贸易的重要农产品资源，出口量在杂粮中位居第二[2]。但近年由于生产成本较高，出口量持续萎缩[1]，因此如何提高蚕豆产量及效益是目前亟待解决的问题。研究表明，根瘤菌可为蚕豆提供生长所需80%的氮源[3]；接种根瘤菌能显著提高蚕豆产量，增加土壤肥力[4-5]。Rugheim等[6]研究表明，接种根瘤菌还可提高蚕豆粗纤维和粗蛋白。可见，接种根瘤菌能有效提高蚕豆的产量及效益。豆科作物接种高效根瘤菌是国际上公认的一种有效生物固氮技术，且相较氮肥，以根瘤菌剂为代表的微生物肥料，成本低、利用率高、对环境无污染，符合发展绿色农业的要求[7]。

近年根瘤菌新功能拓展研究报道指出，少数根瘤菌除固氮外，还具有分泌吲哚乙酸(IAA)、溶磷等新的促生能力[8]。因此，本研究还对供试菌株的促生新功能如分泌IAA、溶磷能力进行初步探索，以期发现固氮效果和促生效果好的菌株，为该地区高效蚕豆根瘤菌剂的研制和应用提供科学依据，进而更好地推动根瘤菌剂的研制和应用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株来自本课题组前期初筛到的6株采集自成都平原且与‘大白蚕豆’高效匹配的蚕豆根瘤菌[15]。菌株编号、来源、土壤类型等信息详见表1。

1.1.2 供试豆种匹配性试验供试品种为‘成胡14’和‘成胡15’，田间试验供试品种‘成胡15’购自四川省农科院。

1.2 研究方法

1.2.1 匹配性试验 (低氮双层钵砂培法) 匹配性试验培养装置上层为装有蛭石 (高压灭菌2～4 h) 的塑料杯 (5 cm × 12 cm)，下层为低氮水培液 (高压灭菌30 min)，用纱布条将上下两层连接。蛭石量为杯高的3/4。低氮水培液配方 (氮含量0.005 g/L)：KCl 0.075 g、K2HPO40.136 g、MgSO40.06 g、Ca(NO3)20.03 g、CaSO40.46 g、柠檬酸铁0.075 g、微量元素1 mL、蒸馏水1 L、pH 7.0。微量元素配方 (pH 7.0)：MnSO41.81 g、ZnSO40.22 g、CuSO4·5H2O 0.8 g、硼酸 2.86 g、钼酸 0.02 g、蒸馏水1 L[18]。

表1 供试菌株基本信息Table 1 Basic information of tested strains

选种、种子催芽和播种方法，以及供试菌培养至对数生长期和接种方法参照Streit等[19]的方法。选两个蚕豆品种颗粒大小、种皮颜色基本一致的健康种子，进行表面消毒，用无菌水浸泡种子过夜，28 ℃进行催芽，等种子长出胚根时，用无菌镊子栽入双层钵上层塑料杯的无菌蛭石中，每杯一株，分别接种6个菌株 (用酵母甘露醇液体于摇床28 ℃，120 r/min培养至对数生长期)，各蚕豆品种以不接菌为对照(CK)，各处理重复3次。在光照室 (控温22～25 ℃，光照强度2800 lx左右，日照时间14 h) 培养41 d后收获，定期补充无菌低氮营养液。收获后测定植株干重和总瘤数。

1.2.2 大田接种试验田间试验在成都崇州市桤泉镇四川农业大学现代研发基地进行。土壤类型为简育水耕人为土 (水稻土)，土壤基本养分状况：pH 7.50，有机质22.8 g/kg，全氮1.31 g/kg，碱解氮104 mg/kg，有效磷18.6 mg/kg，速效钾97.5 mg/kg。本试验共设3个处理，接种根瘤菌SCAUf73、SCAUf76和不接种对照处理 (CK)，每个处理设3次重复，采用田间随机区组排列。试验于2016年10月至2017年4月进行。将制备好的根瘤菌菌剂 (活菌数5.0 × 108CFU/g以上，载体为泥炭) 与蚕豆 (成胡15) 拌种，其中不接菌处理也裹有不加菌液的灭菌泥炭，阴干后穴播，每窝3粒，定苗2株，小区面积10.8 m2，窝距30 cm，行距50 cm；播种时先播CK，以避免CK受接种根瘤菌的影响。管理按农户种植蚕豆的常规管理执行。

在植株盛花期 (生育期105 d) 采样，每个小区采集6株，测定株高、根瘤数、地上部分植株干重；收获期 (生育期200 d，收获鲜食蚕豆) 采样，每个小区采集30株，测定饱荚数、瘪荚数、植株干重、籽粒鲜产；对两个时期植株样品氮、磷、钾含量测定[20]。在盛花期，通过BOX-PCR分子标记法对接种根瘤菌占瘤率进行测定，每个处理随机选取45个根瘤，提取根瘤中类菌体根瘤菌DNA[21]，同时对接种菌株SCAUf73、SCAUf76总DNA进行提取[22]；然后对接种菌株和根瘤类菌体根瘤菌DNA进行BOX-PCR扩增[23]，比较接种菌株及相应根瘤类菌体根瘤菌DNA的BOX-PCR分子指纹图谱，以此获得供试接种菌株的田间占瘤率。

1.2.3 系统发育研究采用GUTC法提取供试菌株(表1) 总 DNA[22]，然后分别用通用引物P1/P6、atpDF1/atpDR、recAF2/recAR2、GSII-5/GSII-6、nifHF1/nifHR1、nodC540/nodC1160[24-27]对其 16S rRNA基因、持家基因 (atpD、recA、glnII)、固氮基因nifH和结瘤基因nodC进行扩增。PCR扩增用Bio-Rad My CyclerTM仪器，PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送成都擎科生物技术公司进行测序。测序结果分析方法及系统发育树的构建同文献[15]。

1.2.4 促生性测定分泌生长素 (IAA) 的能力：采用比色法对供试菌株 (表1) 分泌IAA能力进行定性测定，根瘤菌用改良的刚果红培养液培养[28]，取根瘤菌悬液 100 μL置于白色塑料比色板上，加 100 μL的比色液[28]，15 min后观察颜色变化。粉红色为阳性，表示菌株能够分泌IAA，粉红色颜色越深表示分泌IAA的能力越大；无色为阴性，表示菌株不能分泌IAA。在比色液中分别加入等量的10 mg/L(CK1)、30 mg/L(CK2)、50 mg/L(CK3) IAA作阳性对照进行粉红色颜色深度的比较[28]。对显色结果显示的粉红色深于CK1的菌株进行定量测定，测定方法同文献[29]。

1.2.5 数据分析采用Excel 2010整理试验数据，采用IBM SPSS Statistics 19.0进行数据处理和方差分析。

溶磷能力：采用溶磷圈法对供试菌株 (表1) 溶磷能力进行定性测定。溶有机磷培养基用蒙金娜培养基[28]，其中水为蒸馏水，卵磷脂用75%的酒精加热溶解，单独灭菌，温度降至70 ℃后与培养基混合；溶无机磷能力的测定用PKO培养基[28]，其中水为蒸馏水，3种无机磷源分别为磷酸钙 [Ca3(PO4)2]、磷酸铝 (AlPO4·2H2O)、磷酸铁 (FePO4·2H2O)，均为市售分析纯试剂，无机磷源均需过48 μm筛并单独干热灭菌后与培养基混合。

将供试菌株用点接法接种在预先配好的有机磷源为卵磷脂的蒙金娜培养基和三种无机磷源的PKO培养基上，以接种YMA培养基的处理为阳性对照，各处理重复3次，28 ℃培养7 d。7 d后观察平板上菌株的生长状况，对阳性对照菌落大小、各处理菌落大小及各处理菌落溶磷圈直径进行记录。

2 结果与分析

2.1 供试菌株与蚕豆品种的匹配性

从课题组前期初筛的与四川主栽品种‘大白蚕豆’高效匹配的6株蚕豆根瘤菌与成都平原主栽品种‘成胡14’、‘成胡15’的匹配性结果 (表2) 可知，‘成胡14’接种供试菌株后，除SCAUf60不能使其结瘤，其余5个菌株均能结瘤，每株结瘤量在1 8.3～3 0.7个，S C A U f 7 3结瘤能力最强；SCAUf70、SCAUf76、SCAUf73菌株能使‘成胡14’的植株干重显著增加，分别比CK增加43.7%、43.2%、40.5%。6株供试根瘤菌与成胡15接种结果显示，除SCAUf81以外，其他菌株均能使‘成胡15’结瘤，每株结瘤量在10.3～33.3个，SCAUf73结瘤能力最强；其中SCAUf76、SCAUf73、SCAUf57均能使‘成胡15’的植株干重显著增加，分别比对照增加46.6%、61.6%、54.3%。由上可见，同一品种接种不同根瘤菌处理，其宿主蚕豆的长势及结瘤能力不同；同一根瘤菌，接种不同蚕豆品种，其蚕豆长势及结瘤能力可能存在较大差异。综合两个豆种的匹配性试验以及课题组前期试验结果，SCAUf76、SCAUf73与成都平原3个主栽蚕豆品种 (大白蚕豆、‘成胡 14’ 、‘成胡 15’ ) 都高效匹配，但还需要进行田间接种验证。

表2 匹配性试验中蚕豆盛花期植株干重和结瘤数Table 2 Dry weight and number of nodules of plants at flowering stage in the matching experiment

2.2 田间试验结果

2.2.1 接种根瘤菌对蚕豆生长的影响对前期筛选的2株与成都平原3个主栽品种匹配性好的菌株SCAUf73、SCAUf76进行田间验证。与CK相比，根瘤菌SCAUf73、SCAUf76处理的植株干重盛花期略有增加，收获期显著增加，SCAUf73、SCAUf76分别比CK增加102%、154%。接种两根瘤菌的处理，盛花期和收获期的株高与CK差异都未达显著水平 (P＜ 0.05)。处理SCAUf73、SCAUf76的根瘤数较多，占瘤率分别为33.3%、13.3%。在盛花期SCAUf73的结瘤能力、竞争结瘤能力均优于SCAUf76(表3)。

2.2.2 接种根瘤菌对蚕豆植株养分含量的影响接种优良根瘤菌能有效地促进宿主植物对养分的吸收和积累 (表4、图1)。在盛花期，SCAUf73、SCAUf76处理的植株全氮、全钾含量及氮、磷、钾积累量均高于CK，但差异均未达显著水平。在收获期，SCAUf73处理的植株全氮、全钾含量较CK都有所增加，但差异不显著；SCAUf76处理的植株全钾含量较CK显著增加23.5%，可见接种根瘤菌不仅能促进寄主植物对氮的吸收，还能促进对钾的吸收，这与前人[30-31]研究结果较一致。在收获期SCAUf76、SCAUf73处理的氮积累量分别较CK显著增加151%、122%；磷积累量分别较CK显著增加141%、91.4%；钾积累量分别较CK显著增加213%、132%。综上所述，接种根瘤菌显著增加了植株地上部养分的积累。

2.2.3 接种不同根瘤菌对蚕豆产量的影响接种不同根瘤菌对蚕豆产量的影响存在显著差异。表5显示，接种SCAUf73处理蚕豆的籽粒鲜产比CK显著增加25.0%，而接种SCAUf76处理对蚕豆的籽粒鲜产无明显增加作用。接种根瘤菌SCAUf73、SCAUf76处理的单株结荚数、饱荚数较CK均无显著差异，但SCAUf73处理均略高于CK，SCAUf76处理均略低于CK。

2.3 菌株SCAUf73系统发育分析

对田间筛选适合成都平原蚕豆生产接种的高效广谱菌株SCAUf73进行系统发育分析。从16S rRNA基因系统发育树 (图2) 可知，SCAUf73为Rhizobium属的菌株。三个持家基因atpD、recA和glnII序列联合建树 (图3) 显示，SCAUf73与R.sophoraeCCBAU 03386T相似度最高，为96.9%。一般多位点序列法进行的分类地位研究将97%相似性作为定种的标准[32]，可见，SCAUf73可能是Rhizobium的一个潜在新种菌株。

表3 接种根瘤菌对蚕豆生长及占瘤率的影响Table 3 Effects of rhizobia inoculants on faba bean growth and nodule occupancy

表4 接种根瘤菌对蚕豆植株氮、磷、钾含量的影响 (%)Table 4 Effects of rhizobia inoculants on faba bean growth and total N, P and K contents in plant stems

图1 接种根瘤菌SCAUf76和SCAUf3后盛花期和收获期蚕豆植株氮、磷、钾积累量Fig.1 N, P and K accumulation by faba bean plants inoculated with SCAUf76 and SCAUf3 strains at blooming stage and harvest stage

表5 接种根瘤菌对蚕豆产量的影响Table 5 Effects of rhizobia inoculants on yields of faba bean

图4A显示SCAUf73的nifH基因与R.anhuienseCCBAU 23252T相似度最高，相似度为96%。SCAUf73的nodC基因系统发育树 (图4B) 结果显示，与R.leguminosarumUSDA 2370TnodC基因的相似性最高，相似度为95.7%。可见，SCAUf73菌株的共生基因具有特异性。

2.4 供试菌株促生性能测定

图2 菌株SCAUf73的16S rRNA 基因系统发育树Fig.2 16S rRNA phylogenitic tree of SCAUf73

图3 菌株SCAUf73的recA-atpD-glnII序列联合构建的系统发育树Fig.3 Phylogenitic tree of SCAUf73 concatenated byrecA-atpD-glnII

图4 菌株 SCAUf73的共生基因nifH(A)、nodC(B) 系统发育树Fig.4 Phylogenitic tree of SCAUf73 based on symbiotic genes ofnifH(A) andnodC(B)

对供试菌株分泌IAA的能力和溶磷能力进行了测定。结果 (表6) 显示，6个供试菌株均有分泌IAA的能力。其中SCAUf60、SCAUf73、SCAUf81比色后显示的粉红色比CK1(10 mg/L IAA) 弱，表示分泌IAA的量都低于10 mg/L。处理SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76比色结果显示的粉红色介于CK1及CK2之间，表明分泌IAA的量介于10～30 mg/L；SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76分泌IAA的能力较强，因此对其进行定量检测，结果表明其分泌IAA的量分别为19.7、17.3、21.0 mg/L。

表7表明，全部供试菌株均能在蒙金娜培养基上生长，除SCAUf60、SCAUf76处理长势比阳性对照 (pH 7的YMA平板) 好，其他菌株与阳性对照直径比值均≤ 1。菌株SCAUf60、SCAUf73、SCAUf 81在3种无机磷源 (磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁) 的PKO培养基均能生长，而SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76仅能在2种无机磷源 (磷酸钙、磷酸铝) 的PKO培养基上生长；所有处理除SCAUf57、SCAUf60、SCAUf76、SCAUf81在磷酸钙培养基上的长势较阳性对照好外，其他所有处理菌株与阳性对照直径比值均 ≤ 1。所有处理均未产生明显的溶磷圈，溶磷圈直径与菌落直径相当。

3 讨论

目前对根瘤菌的筛选主要经过三个步骤，首先用大量菌株针对宿主用水培或砂培法进行接种，筛选共生固氮效果好的菌株；其次，在温室条件下，以目标地区土壤为介质复筛出固氮能力强、竞争结瘤能力强的复筛菌株；最后在目标地区进行田间试验验证后方可在其大区推广[8,12]。由于成都平原地区蚕豆的主要种植土壤为水稻土，因此田间验证试验设在成都平原水稻土上进行。本试验筛选得到一株高效广谱根瘤菌SCAUf73，但占瘤率仅为33.3%，可能是由于试验田土壤的全氮1.31 g/kg，碱解氮104 mg/kg，均达丰富水平[33]，土壤比较肥沃。有研究表明根瘤菌的接种效果在肥力越低的土壤中效果会越明显[34]，因此SCAUf73在肥力较低的土壤中接种效果应更佳，占瘤率也应增加。目前国家正在实行双减 (化肥与农药减施) 政策，随着政策的逐步实施，我国土壤的肥力，尤其是氮水平应该有所降低，因此SCAUf73在成都平原蚕豆生产中具有较好的应用前景。

表6 供试菌株分泌IAA的能力 (mg/L)Table 6 The ability to secrete IAA in the tested strains

表7 溶磷能力定性试验Table 7 Qualitative test of phosphate solubilization ability

目前国内外对蚕豆高效根瘤菌筛选多数是与单个豆种进行匹配性研究[4-6]。伍惠等[17]对8株优良大豆根瘤菌与27种大豆品种进行匹配性研究，结果发现同一大豆品种的8个接种处理间根瘤数存在很大差异，差异大的可相差8倍，甚至菌株HH29接种对品种Willimus82的根瘤数为0，其他7个菌株接种Willimus82的根瘤数为每株23.5～85.8个。本试验也发现，前期筛选得到的与大白蚕豆高效匹配的6株根瘤菌中，仅2株菌与成胡14、成胡15高效匹配，且其中SCAUf60不能使成胡14结瘤，SCAUf81不能使成胡15结瘤。这些结果说明，在进行根瘤菌优良菌株的筛选过程中，与当地多个主栽豆种的匹配性试验是适用高效菌株筛选必不可少的环节。但将通过砂培 (或水培) 试验初筛的优良菌株应用到田间，其效果可能存在很大差异。周涛等[30]通过水培试验从分离自四川的75个大豆根瘤菌中筛选到6个与四川主栽大豆品种“贡选1号”高效匹配的菌株，运用到大田试验中仅2株菌表现出良好的固氮效果。而本试验对前期砂培初筛的与成胡15高效匹配的SCAUf76，在田间接种后却对成胡15蚕豆无明显增产作用。主要可能是由于砂培 (水培) 试验条件较单一，影响因素较少，而土壤环境错综复杂，土著根瘤菌的竞争性强 (SCAUf76占瘤率仅为13.3%) 等因素都会影响其接种效果，且砂培 (水培) 试验在温室下的花期采样，有研究表明某些根瘤菌的固氮效果主要在盛花期后期充分发挥[30]。由此可见，砂培(水培) 试验筛选的高效根瘤菌还需要通过田间试验进一步验证。

某些根瘤菌固氮效果并不明显，但其较强的促生能力依然能有效促进植株生长[28,35]。本试验中SCAUf76，在收获期植株的含氮量比CK略低，但植株干重比CK显著增加154.3%，可能与SCAUf76具有较强分泌IAA的能力有关，它在所有供试菌中分泌IAA的能力最强，可达21.0 mg/L；该试验植株接种根瘤菌的量约为9.3 × 107CFU/粒种子，植株的结瘤数仅为58.6个/株，由此可见接种的根瘤菌只有少部分能使植株形成根瘤，其他大部分作为根际促生菌分布于根际，而IAA能够有效地促进植株的生长；还可能与该菌的溶钾能力有关，有研究表明某些根瘤菌能够促进植物对钾的吸收[30-31]，SCAUf76处理在收获期植株全钾含量较CK显著增加23.5%，但SCAUf76的溶钾能力还有待进一步研究。

某些根瘤菌还具有溶磷能力，将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的磷，对植物生长起着促进作用[28,35]。目前常用溶磷圈法测定菌株的溶磷能力，本试验所有菌株均未产生明显的溶磷圈。但有研究表明，某些在培养液中具有溶磷现象的溶磷菌在平板培养基上没有产生明显的溶磷圈，由此可见溶磷圈法仅能作为参考[36-37]。本研究发现菌株SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76在磷源为磷酸铁的培养基上不能生长，但能在其他2种磷源 (磷酸铝、磷酸钙) 的PKO培养基上生长良好，由此可以说明，菌株只要在用蒸馏水配制的溶磷培养基上生长较好，尽管溶磷圈不明显，也可能具有溶磷能力。根瘤菌在PKO及蒙金娜培养基上长势与阳性对照(YMA，pH 7.0) 的比值，可在一定程度上衡量菌株的溶磷能力。综上所述，本研究全部菌株均能在有机磷培养基上生长，可能具有一定的溶有机磷能力；其中SCAUf60、SCAUf76在有机磷培养基上的长势较阳性对照好，可能具有较好的溶有机磷能力；SCAUf57、SCAUf70、SCAUf76仅能在磷酸钙、磷酸铝培养基上生长，因此可能具有溶磷酸钙、磷酸铝的能力，不具有溶磷酸铁的能力；SCAUf60、SCAUf73、SCAUf81处理均能在3种PKO培养基上生长，可能具有溶解磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁这3种无机磷的能力；其中SCAUf76、SCAUf57、SCAUf60、SCAUf81处理在含磷酸钙的PKO培养基上的长势比阳性对照好，可能具有较好溶解磷酸钙的能力，但还需定量试验进一步验证。