蚓粪减轻苹果砧木平邑甜茶幼苗连作障碍的土壤生物学机制

潘凤兵，王海燕，王晓芳，陈学森，沈 向，尹承苗，毛志泉

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

苹果连作障碍又叫苹果再植病 (apple replant disease，ARD)，是苹果重茬栽培时发生的综合病症[1-2]。生产上克服连作障碍的方法主要有合理的轮作、间作和套种、土壤消毒、添加有机物料、抗性育种和生物防治等方法[3-5]。但传统的单一防治方式均有一定的局限性，不能及时有效地改善连作状况。因此，寻找缓解和克服苹果连作障碍简单有效的防控技术，对苹果产业的可持续发展具有十分重要的意义。

大量研究表明，添加土壤改良剂可以缓解连作障碍的发生，其中有机物料和蚓粪有效降低了连作障碍的危害[6-9]。袁玉娟等[10]研究表明，使用不同生物有机肥可显著降低黄瓜土传枯萎病的发病率，降低病原真菌对根系的侵染，提高黄瓜生物量。田给林等[11]发现，蚯蚓粪与牛粪和无机肥料相比具有显著的生物活性。在草莓连作土壤灭菌后施用具有生物活性的蚯蚓粪，可以促进根系生长，缓解土壤灭菌对草莓植株生长发育的影响。赵凤艳等[12]认为通过蚓粪处理番茄连作土壤可提高土壤养分含量，显著降低优势真菌相对丰度，从而缓解番茄连作障碍。蚓粪作为一种植物有机营养物料，几乎具备了植物生长所需的全部有益因素，施入蚓粪后在提高土壤有机质、全碳和全氮的基础上，对真菌也有一定的抑制作用。也有研究发现，施用蚯蚓粪后，土壤中的微生物总量和微生物量氮均有所提高，同时也促进了土壤酶活性的提高[13]。目前国内外关于蚓粪防治连作障碍的研究主要集中在蔬菜等领域。大量研究结果表明，蚓粪可有效降低蔬菜连作所造成的危害，而蚓粪对苹果连作障碍的影响及作用机理尚未见报道。本试验以苹果栽培中的常用砧木平邑甜茶为试材，探讨蚓粪对苹果连作障碍的防控效果及其作用机理，以期为有效防治苹果连作障碍提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苹果连作土壤取自山东省泰安市满庄镇25年生的红富士老果园，砧木为八棱海棠 (Malus robustaRehd.)。土壤类型为棕壤，土壤pH值为6.2、有机质含量为9.35 g/kg、速效磷含量为15.9 mg/kg、速效钾含量为152 mg/kg、铵态氮含量为13.1 mg/kg、硝态氮含量为7.68 mg/kg。

供试材料为平邑甜茶 (Malus hupeheusisRehd.) 实生苗。供试蚓粪为大平1号蚯蚓 (Eisenia foetida) 粪便，有机质含量为261.1 g/kg、速效磷含量为1348 mg/kg、速效钾含量为3732 mg/kg、铵态氮含量为1208 mg/kg、硝态氮含量为840.8 mg/kg。

1.2 试验设计

试验于2016年12月至2017年12月在山东农业大学园艺科学与工程学院国家苹果中心实验基地进行。试验设4个处理：连作土对照 (CK)、连作土灭菌 (TM)、连作土施蚓粪 (YF)、连作土施灭菌蚓粪(MYF)。连作土及蚓粪灭菌均采用高压蒸汽灭菌法，蚓粪与灭菌蚓粪的施用量为土壤总体积的20%[11,14]。

幼苗移栽前分别处理连作土壤并装盆 (试验用盆采用上部内径25 cm，盆底内径17 cm，高18 cm的花盆)，每个处理20盆，每盆装供试土壤6.5 kg。幼苗长到3片真叶时，选取三棵长势一致的幼苗移栽到装有不同处理供试土壤的盆中，待缓苗结束后保留2棵长势基本一致的植株。平邑甜茶幼苗移栽后，所有处理均采用统一肥水管理，于9月底取样测定平邑甜茶幼苗生物量、根系相关指标、土壤微生物环境及土壤酶活性等指标。

1.3 测定指标

生物量的测定：使用卷尺、游标卡尺测定平邑甜茶幼苗的株高、径粗。用自来水将幼苗地上部和根系冲洗干净，擦干植株表面水分后使用万分之一天平测定植株鲜重，然后将植株装入牛皮信封杀青烘干后进行干重的测定。

根系形态指标的测定：参照肖宏等[15]的方法，采用国产NUS700根系扫描仪测定平邑甜茶幼苗根系的总长度、表面积、根体积和根尖数。

根系呼吸速率的测定：采用氧电极自动测定系统 (Qxytherm System，Hansatech公司) 测定样品呼吸速率[16-17]。

根抗氧化酶的测定：超氧化物歧化酶 (SOD) 活性的测定采用氮蓝四唑 (NBT) 光还原法[18]；过氧化物酶 (POD) 的活性按Omran等[19]的方法测定；过氧化氢酶 (CAT) 活性按照Singh等[20]的方法测定。

土壤微生物的测定：土壤细菌、真菌、放线菌的测定均采用稀释平板计数法，测定前计算水分系数。细菌采用土壤浸出液牛肉膏蛋白胨培养基37℃条件下培养，真菌采用PDA选择性培养基28℃条件下培养，放线菌采用改良高氏培养基28℃条件下培养[21]。

土壤酶活性的测定：土壤中性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法；土壤脲酶活性测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；土壤蔗糖酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法；土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法[22]。

实时荧光定量 (real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)：参照尹承苗等[23]的方法，提取土壤总DNA并纯化；参照王艳芳等[24]的方法设计尖孢镰刀菌PCR引物，正向引物序列：GTGAACATACCACTTGTTGCCTC，反向引物序列：GAGTCCCAACACCAAGCTGTG；采用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad) 对不同处理土壤中尖孢镰孢菌的基因拷贝数进行定量分析[25]。

1.4 数据分析

试验数据用Microsoft Excel 2010进行处理，采用SPSS 19.0进行方差分析，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检测。

2 结果与分析

2.1 不同处理下植株生长状况

2.1.1 地上部 由表1可以看出，与CK(连作土对照)相比，各处理的生物量都明显提高。连作土壤施蚓粪处理和连作土施灭菌蚓粪处理的效果仅次于连作土 灭菌处理，且显著高于CK。其中，连作 土壤施蚓粪处理和连作土施灭菌蚓粪处理的植株干重分别比CK提高了351.1%和348.2%。

2.1.2 根系 连作土施蚓粪和连作土施灭菌蚓粪均显著促进了平邑甜茶幼苗根系的生长 (表2)。其中，连作土施蚓粪处理的总根长、表面积、根体积和根尖数分别比CK提高74.5%、27.9%、84.0%和130.5%，连作土施灭菌蚓粪处理分别提高62.3%、19.0%、70.4%和119.0%。

由图1可知，蚓粪的添加促进了平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的提高。与CK相比，连作土施蚓粪处理的SOD、POD和CAT活性提高了33.4%、392.4%和241.4%。蚓粪同时促进了平邑甜茶根系呼吸速率的提高，连作土施蚓粪和连作土施灭菌蚓粪的根系呼吸速率分别比CK提高了44.9%和60.0%。

2.2 不同处理下连作土壤的生物学特性

2.2.1 可培养微生物 蚓粪提高了连作土壤中细菌、放线菌数量，同时降低了真菌数量。与CK相比，连作土施蚓粪处理的细菌、放线菌数量分别增加了107.8%和97.7%，而真菌数量减少了17.1% (图2)。2.2.2 尖孢镰刀菌 由图3可以看出，与CK连作土对照相比，不同处理均使尖孢镰刀菌数量显著降低，以连作土灭菌处理的效果最好，连作土施蚓粪和连作土施灭菌蚓粪的施入使尖孢镰刀菌的基因拷贝数分别降低了51.0%和57.6%。

表1 不同处理对平邑甜茶株高、地径和干重的影响Table 1 Effects of different treatments on the plant height, diameter and dry weight ofM.hupehensisRehd.seedlings

表2 不同处理对平邑甜茶根系形态的影响Table 2 Effects of different treatments on the root morphology ofM.hupehensisRehd.seedlings

图1 不同处理对平邑甜茶根系呼吸速率和抗氧化酶活性的影响Fig.1 Effects of different treatments on root respiration rate and antioxidant enzyme activities ofM.hupehensisRehd.seedlings

2.2.3 酶活性 连作土施蚓粪和连作土施灭菌蚓粪处理的土壤酶活性显著高于连作对照，其中连作土施蚓粪处理的土壤磷酸酶、脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性分别比CK提高了97.9%、540.9%、213.1%和109.4%。连作土壤添加蚓粪可以明显提高土壤酶尤其是脲酶的活性 (图4)。

3 讨论

3.1 蚓粪对苹果连作障碍土壤性质的影响及其机理

有害真菌数量的增加是造成苹果连作障碍的主要原因[26]。蚯蚓粪可以提高土壤中微生物的生物量，随着蚯蚓粪添加量的提高，土壤中细菌和放线菌的种类和数量增加明显，而真菌不是微生物增加的主要因素[27]。番茄连作土壤中施用蚓粪后，土壤放线菌数量有效增加，真菌数量降低，土壤中放线菌真菌比值提高[28]。在本试验中，也证实苹果连作土壤添加蚯蚓粪后，细菌和放线菌数量显著提高，真菌数量显著下降。蚯蚓粪的添加促使连作土壤微生物由真菌主导型向细菌主导型转变，有害真菌数量得以降低，从而达到减轻苹果连作障碍的目的[29-30]。

图2 不同处理土壤微生物数量Fig.2 Population of soil microorganisms under different treatments

图3 实时荧光定量分析的尖孢镰刀菌基因拷贝数Fig.3 Gene copies ofFusarium oxysporumanalyzed by real-time quantitative analysis

Gil-Sotre等认为，包括蔗糖转化酶、脲酶、过氧化氢酶、酸性和中性磷酸酶等在内的土壤酶对土壤中微生物的活动非常敏感[31]，土壤酶活性可作为衡量土壤生物学活性和土壤肥力的指标之一[22,32]。在本研究中，施入蚓粪可显著提高连作土壤中土壤酶尤其是脲酶的活性，且施入蚓粪的效果要优于灭菌蚓粪；研究结果与张池等[33]和田给林等[11]的研究结果一致。土壤酶活性的提高可以影响连作土壤中养分的释放，提高土壤微生物活性和土壤肥力状况，从而促进果树生长，减轻连作障碍造成的危害[34]。

3.2 蚓粪对苹果连作障碍土壤平邑甜茶幼苗的影响及其机理

苹果连作障碍普遍存在于我国各个苹果优势产区，发生连作障碍的果树症状表现为：植株矮小、生长缓慢、叶片变小、根系分生能力差、植株发育缓慢等[1-5]。生物量是表征植物生长状况的一项基本参数，生物量的大小对植物生长发育的影响至关重要[24]。有研究表明，蚓粪可刺激番茄幼苗和根系的生长，从而显著促进番茄植株生长，提高番茄产量[35-36]。尹恩等[37]的研究发现，生姜连作土壤加入蚓粪，可显著提高生姜的株高、茎粗、叶片数和分枝等生长指标。本试验中，施入蚓粪与灭菌蚓粪处理的平邑甜茶生物量显著高于连作对照，与上述研究结果一致，这说明蚓粪可以促进平邑甜茶幼苗的生长，缓解连作障碍产生的危害。蚓粪与灭菌蚓粪处理植株生物量没有达到显著差异，说明蚓粪中的微生物并不是促进植株生长的主要原因。

图4 不同处理的土壤酶活性Fig.4 Soil enzyme activities under different treatments

研究证明，连作条件下，果树幼苗总根长和平均根直径均有所下降，这些根系指标的下降导致根系对养分吸收能力的降低，最终使得地下部干物质积累量的减少，进而导致连作障碍的发生[29]。王树风等[38]的研究表明，逆境条件下，植物根系生长受到抑制，从而影响根系在逆境中的分布范围，影响植物对水分和营养元素的吸收，进而影响植物生长。本试验中，施入蚓粪和灭菌蚓粪后平邑甜茶幼苗的总根长、根表面积、根体积和根尖数等根系指标显著提高，明显高于连作对照，仅次于本试验的高标对照灭菌土处理。Tomati等[39]研究发现，蚓粪中含有生物活性物质和生长素、赤霉素、细胞分裂素等植物生长调节剂，这些物质可以刺激植物根系活力，促进植物生长发育。健康的根系可促进平邑甜茶幼苗的生长发育，对缓解苹果连作障碍具有重要意义。健康的根系也可以促进根系的呼吸作用，根系呼吸作为植株地下部代谢的重要过程，不仅为植物生命活动提供原料和能量，更是衡量根系功能、指示根系物质与能量变化的敏感指标，因此根系呼吸作用对植物养分的吸收、根系更新、植株生长具有重要意义[40]。根系呼吸所产生的大部分能量用于营养物质的吸收，呼吸作用的降低使营养离子吸收受到抑制，从而减缓植物生长[41]。本试验结果显示，添加蚓粪和灭菌蚓粪可显著提高平邑甜茶幼苗根系的呼吸速率，从而提高根系活力，促进根系对营养物质的吸收，促进植株生长，提高抗逆性，这对缓解苹果连作障碍有非常积极的作用。

正常条件下，植物细胞中活性氧的产生和清除处于动态平衡的状态，而当植物遭遇到较强逆境时，活性氧大量产生，使植物体内的抗氧化酶系统与活性氧之间的动态平衡被打破，细胞不能及时清除多余的活性氧而对植物造成伤害[42]。连作土壤中，由于微生物环境恶化、酚酸等化感物质积累和土传病害加重等原因，使植物根系内的活性氧大量积累，进而伤害植株根系，影响根系对营养元素和水分的吸收和利用，导致连作障碍的发生[43]。超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶(CAT) 是植物体内清除多余活性氧的重要的抗氧化酶，较高的SOD、POD和CAT活性可以有效抑制活性氧的过量积累[44]。本研究中，蚓粪或灭菌蚓粪的添加，使平邑甜茶幼苗根系的抗氧化酶活性显著提高，从而降低植物体内活性氧的数量，降低活性氧的过量积累对植株造成的损伤，促进植株根系生长，提高抗逆性，降低苹果连作障碍的危害[37]。

4 结论

在连作土壤中施入蚓粪或灭菌蚓粪可显著改善连作土壤微生物环境，提高土壤酶活性，促进植株根系健康生长，提高平邑甜茶幼苗的生物量，从而减轻苹果连作障碍带来的危害。蚓粪与灭菌蚓粪处理未达到显著差异，说明蚓粪中的微生物并不是其减轻苹果连作障碍的主要原因。苹果连作障碍的减轻可能是蚓粪中的有机营养、微生物和蚯蚓产生的抗菌肽共同作用的结果，但关于其机理仍需进一步研究。