双季稻田冬闲期土壤细菌数量及结构对施氮的响应

2019-07-13聂江文王幼娟吴邦魁刘章勇

植物营养与肥料学报 2019年6期

聂江文，王幼娟，吴邦魁，刘章勇，朱波*

（1 主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北荆州 434025；2 长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心/湖北省涝渍灾害与湿地农业重点实验室，湖北荆州 434025）

水稻 (Oryza sativa) 是我国重要的粮食作物之一，稻田土壤质量的可持续性对水稻持续高产稳产有着极其重要的作用。氮肥的施入对水稻产量的提升有着巨大的贡献[1]。据统计，稻田氮肥施用量达到我国氮肥总消费量的30%以上[2]。虽然稻田氮肥的大量施入可以在短期内迅速提升水稻产量，但不合理的施氮措施将导致氮肥的利用效率低下[3]、土壤板结、土壤性质改变[4]、氮素流失加快[5]以及温室气体排放增加[6]，对生态环境造成严重的影响。此外，无机氮肥在为作物生长提供必需养分的同时[7]，对土壤微生物的群落结构和数量也产生重要影响[8]，土壤微生物作为农田生态系统的重要组分，对于促进土壤有机质的分解以及土壤养分的转化具有关键作用，进而维持土壤质量的可持续和土壤的健康发展[9]。

研究发现，不同的种植制度、施肥措施和土壤理化性质的改变等均会对土壤细菌群落数量及结构造成影响[10-11]，其中，影响最为显著的是氮肥施用与土壤pH的改变。Zhou等[12]研究表明，土壤pH下降、细菌菌群的结构和数量变化与长期氮肥施用有关；RAMIREZ等[13]研究发现，高氮量肥料的施用会导致土壤中细菌群落组成发生明显变化，并造成土壤中主要细菌生活史的改变；秦杰等[14]采用高通量测序方法研究表明，在长期不同施肥条件下土壤细菌和古菌的群落结构都发生了显著改变。目前大量的科研工作主要集中于施氮对作物生育期内土壤理化性质的影响以及土壤肥力生物学特征的评价，而对施氮后冬闲期土壤质量的评价较为少见，缺少施用氮肥后对冬闲期稻田土壤的细菌数量与结构影响的研究。

以3种氮肥水平下的双季稻田耕层土壤为研究对象，采用real-time PCR技术和高通量测序技术(Illumina HiSeq)，探讨不同施氮处理对稻田冬闲期土壤细菌的数量及群落结构产生的影响，并分析土壤菌群与环境因子的相关关系，为进一步了解施氮对双季稻田土壤细菌群落结构的变化的影响和双季稻区水稻可持续生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验设计

试验在湖南省华容县长江大学试验基地 (东经112º55′、北纬 29º52′) 进行。当地气候为亚热带季风湿润气候，年均气温16℃～18℃，≥ 10℃积温5000℃～5800℃，无霜期260～310 d，年降雨量1200～1700 mm。试验土壤类型为长江沉积物发育形成的紫潮泥水稻土。试验前土壤肥力指标如下：有机质含量49.2 g/kg、全氮含量3.11 g/kg、碱解氮273 mg/kg、有效磷16.4 mg/kg、速效钾69 mg/kg、pH 7.7。

长期施氮试验始于2008年，耕作制度为冬闲-双季稻，试验设计：双季不施氮 (CK)、每季各施N 100 kg/hm2(N1)、每季各施N 200 kg /hm2(N2)。每季磷肥 (P2O5) 施用量均为75 kg/hm2，钾肥 (K2O) 均为100 kg/hm2，氮肥、磷肥和钾肥分别为尿素、磷酸二氢钙和硫酸钾。每个处理3次重复，小区面积29.7 m2(长9.0 m、宽3.3 m)，随机区组排列。

1.2 土壤样品采集及土壤化学性质测定

于2016年3月稻田冬闲期 (田间表层无水) 采集5—20 cm土样，每个小区随机选取3个样点，剔除样品中所含的石砂和植物残渣等大块杂物，混合均匀后用聚乙烯封口袋储存。用于土壤微生物群落分析的土样用锡箔纸包裹后迅速转移至液氮中，冷藏于-80℃冰箱；用于测定铵态氮和硝态氮的鲜土壤样品装入聚乙烯封口袋冷藏于4℃冰箱；剩余土壤样品待自然风干后测定土壤pH、全碳和全氮含量。

采用酸度计法测定土壤pH (土水比1∶2.5)；采用 2 mol/L KCl浸提—靛酚蓝比色法测定铵态氮；采用双波长紫外分光光度法测定硝态氮；采用碱解扩散法测定碱解氮；用元素分析仪 (型号Costech ECS 4024 CHNSO，NC Technologies，意大利) 测定全氮和全碳。

1.3 土壤总DNA提取

用DNA试剂盒 (MOBIO Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，USA) 法提取0.25 g鲜土中的总DNA。DNA纯化及检测参考文献[15]进行。

1.4 PCR扩增及Illumina高通量测序技术

使用Illumina Hiseq平台进行PCR扩增和测序，测序引物选择16s rDNA基因V4区338F (5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′) 和 806R (5′-GGACTA CVSGGGTATCTAAT-3′)，两端引物都加有barode序列标签 (12 mer)。PCR扩增体系参考文献[15]配制。

1.5 荧光定量PCR

使用ABI 7500 (ABI，USA) 实时荧光定量PCR系统测定细菌16s rDNA基因丰度。反应体系：SybrGreen qPCR Master Mix (2X) 15.5 µL，引物 338F(10 μmol/L) 0.8 µL，引物 806R (10 μmol/L) 0.8 µL，Template (cDNA) 2 µL，补加 ddH2O 至 20 µL。PCR循环条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，40个循环，55℃ 1 min，40个循环。

1.6 数据分析

高通量测序所得的数据进行优化、去杂和OTU分类 (相似度＞ 97%)，具体方法参考文献[15]。然后进行分类学分析，即以Silva的16s rDNA基因数据库 (http：//www.arb-silva.de/) 为参考数据库，进行RDP (Ribosomal database project) Classifier[16]序列比对，最低置信度为0.80。

1.7 统计分析方法

采用Excel 2007和SPSS 19.1软件对数据进行方差分析及作图，并使用SPSS 19.1软件对土壤化学性质与土壤微生物群落数量及结构进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 水稻产量

如表1所示，不同施氮处理下双季稻产量存在显著差异 (P＜ 0.05)。与CK相比，N2和N1均显著增加了早稻、晚稻产量，而N1与N2间产量不存在显著差异。

表1 不同施氮水平下水稻产量 (kg/hm2)Table 1 Rice yields affected by different nitrogen application rates

2.2 土壤化学性质

不同施氮处理稻田冬闲期土壤化学性质存在显著差异 (表2)。不同施氮处理土壤pH为7.22～7.63之间。与CK相比，施氮显著降低了冬闲期土壤pH。与CK相比，施氮肥 (N1、N2) 显著提升了土壤的总氮、全碳，降低了硝态氮、碳氮比 (P＜0.05)，对碱解氮的影响不显著。与CK相比，N1处理显著降低了冬闲期土壤的铵态氮含量，而N2处理显著增加了稻田冬闲期土壤铵态氮。

2.3 土壤总细菌的丰度

施加氮肥显著增加了稻田冬闲期土壤的总细菌丰度 (图1)。CK、N1、N2处理每克干土中细菌16s rDNA 的基因拷贝数依次为 1.7×108、80×108、67×108，N1处理是CK的48.25倍，N2处理是CK的40.31倍。土壤16s rDNA基因丰度与土壤化学性质的 Spearman 相关性分析结果显示，稻田土壤细菌数量与土壤全氮呈极显著正相关(0.89**)，与土壤全碳呈显著正相关(0.87*)，与土壤碳氮比呈显著负相关(-0.86*)，而与其他四个土壤化学性质指标无相关性。

表2 不同氮肥水平下双季稻田土壤化学性质Table 2 Chemical properties of double cropping rice fields affected by different nitrogen application rates

图1 不同施氮水平下土壤细菌16s rDNA基因拷贝数Fig.1 Copies of bacterial 16s rDNA genes in soils with different nitrogen application rates

2.4 测序结果和多样性指数

表3所示，对16s rDNA基因测序所得的序列进行分析，每个样品含18513～24016条序列数，1732～1788个OTUs数。样品测序覆盖度在0.9826～0.9891，所获得样品稀释性曲线如图2，曲线均趋于平坦饱和，表明在此测序深度所得序列数据量可以充分反映冬闲期土壤样品微生物信息。

表3表明，N2处理的Ace指数显著高于CK、N1处理（P＜0.05），CK与N1差异不显著。各处理Chao l指数在1937～1957之间，CK与施氮处理间差异不显著，N2处理显著高于N1（P＜0.05）。虽然Ace指数与Chao1指数因算法不同而导致结果略有差异，但两者的结果都说明了施氮并没有改变土壤细菌的丰富度，但不同施氮水平间存在差异。香农(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数结果显示，N2处理香农指数显著低于CK，但其辛普森指数显著高于CK；N1处理香农指数显著高于CK，但其辛普森指数显著低于CK。这说明与CK相比，N1处理对稻田土壤细菌的丰富度无显著影响，但会提高稻田土壤细菌的多样性；N2处理显著增加了稻田土壤细菌的丰富度，但显著降低了稻田土壤细菌的多样性。

2.5 土壤细菌群落优势菌群差异

图3a 显示，Proteobacteria (变形菌门) 是所有处理中门水平相对丰度最高的群落，达40.16%～51.16%，随后依次是Chloroflexi (绿弯菌门) 13.69%～19.73%、Nitrospirae (硝化螺旋菌门) 8.16%～11.46%、Acidobacteria (酸杆菌门) 5.65%～12.25%、Bacteroidetes (拟杆菌门) 4.32%～5.23%、Actinobacteria (放线菌门) 2.25%～2.68%、Chlorobi(绿菌门) 1.68%～2.52%、Gemmatimonadetes (芽单胞菌门) 1.6%～2.13%、Latescibacteria 0.92%～1.51%、Parcubacteria 0.72%～1.05%、Cyanobacteria (蓝藻门)0.71%～2.71%、Firmicutes (厚壁菌门) 0.47%～0.97%。其中，N1处理的绿弯菌门、酸杆菌门以及放线菌门细菌的相对丰度均显著高于CK，而N1处理的变形菌门、硝化螺旋菌门以及拟杆菌门细菌的相对丰度均略低于CK；N2处理的变形菌门和硝化螺旋菌门细菌的相对丰度均显著高于CK及N1，但其绿弯菌门和酸杆菌门细菌相对丰度均显著低于CK及N1。可见，施氮改变了稻田土壤细菌门水平群落结构。

表3 不同施氮水平下土壤细菌测序结果、丰富度及多样性Table 3 Sequencing, reichness and diversity indices of soils with different nitrogen application rates

图2 不同处理土壤OTUs的稀释性曲线 (相似度97%)Fig.2 Rarefaction curves of the OTUs number at 97%similarity for different soil samples

3个施氮处理土壤细菌相对丰度最高的10个属水平菌群分类如图3b所示，属水平菌群相对丰度最高的是Anaerolineaceae_uncultured(厌氧绳菌属) 和Nitrospira(硝化螺旋菌属)，其相对丰度分别是8.6%～14.56% 和8.16%～11.46%。随后依次是Sva0485_norank(2.71%～4.5%)、Nitrosomonadaceae_uncultured(3.05%～3.54%)、43F-1404R_norank(1.98%～4.99%)、Sh765B-TzT-29_norank(2.97%～3.11%)、Subgroup_6_norank(1.89%～6.06%)、B1-7BS_norank(1.93%～2.24%)、Alcaligenaceae_uncultured(1.82%～1.91%)、GR-WP33-30_norank(1.58%～1.88%)。其中，N1处理硝化螺旋菌属相对丰度显著高于N2及CK (P＜ 0.05)，N2处理硝化螺旋菌属相对丰度显著低于CK。可见，不同施氮水平均改变了稻田土壤细菌的属水平群落结构。

2.6 土壤细菌门水平群落结构与土壤化学性质的相关性分析

土壤化学性质与土壤优势门水平菌群相对丰度的Spearman相关性分析显示 (表4)，11个优势门水平菌群均与土壤化学性质存在显著的相关性。绿弯菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿菌门和Latescibacteria与土壤pH呈显著负相关；放线菌门与土壤总氮呈显著正相关，Parcubacteria和蓝藻门与土壤总氮呈显著负相关；硝化螺旋菌门和厚壁菌门与土壤碱解氮呈显著正相关，芽单胞菌门与土壤碱解氮呈显著负相关；Parcubacteria和蓝藻门与土壤硝态氮呈显著正相关；芽单胞菌门与土壤铵态氮呈显著负相关，厚壁菌门与土壤铵态氮呈显著正相关；放线菌门与土壤碳氮比呈显著负相关；Parcubacteria和蓝藻门与土壤全碳呈显著负相关。

3 讨论

3.1 施氮对水稻产量及稻田土壤化学性质的影响

图3 不同施氮水平下土壤细菌门 (a) 和属 (b) 的相对丰度Fig.3 Relative abundance of soil bacteria at phylum (a) and genus (b) affected by different nitrogen application rates

表4 土壤优势菌群门相对丰度与土壤化学性质的 Spearman 相关性分析Table 4 Spearman's correlation coefficients between soil dominant bacteria (phylum) and soil physiochemical characteristics

施加氮肥除了可以显著提高水稻产量，还对土壤的化学性质产生显著影响。本研究中，各施肥处理土壤pH在7.22～7.63之间，与CK相比，施氮均显著降低稻田土壤pH。而多数研究结果表明，氮肥的过量施用会导致土壤pH降低，土壤酸化[14,17-18]，这与本研究结果相一致。与CK相比，施氮肥 (N1、N2) 能显著提升土壤的总氮、全碳，但降低了土壤的硝态氮、碳氮比 (P＜ 0.05)，这与秦杰等[14]的研究结果相似，氮肥的投入可提升土壤的供氮能力，与此同时氮肥影响水稻的生长，促进水稻根系的生长并逐年累积在稻田土壤中，造成土壤全碳的增加。施氮促进根系的生长[19]，并且会导致根系硝酸还原酶活性增加[20]，消耗土壤中的硝态氮，从而导致施氮条件下硝态氮降低。与不施氮肥 (CK) 相比，N1处理显著降低了土壤铵态氮水平，N2处理显著增加了土壤铵态氮，这可能是由于氮肥的投入促进了水稻对土壤速效氮的吸收，而N2处理本身施氮量高于N1处理，其氮肥供应能力也强于N1处理。

3.2 施氮对稻田土壤细菌数量和多样性的影响

土壤微生物活性可用土壤细菌的数量来表征。本研究中不同施肥处理细菌16s rDNA基因拷贝数为每克干土 1.7 × 108～80 × 108个，远低于 Shen 等[21]在水稻田中1010数量级的细菌数量和杨亚东等[22]发现华北平原小麦土壤细菌数量 5.74 × 109～7.5 × 109，这可能与土壤类型[23]和种植作物[24]有关。在旱地土壤中，长期施用氮肥往往降低或不会显著影响细菌数量[22,24]。本研究发现施氮显著增加冬闲期稻田土壤细菌的数量，且细菌数量与土壤全氮和全碳含量呈显著相关，袁红朝等[25-26]在水稻土的研究结果也是如此。其主要原因是施氮为水稻的根系生长提供了充足的氮营养，促进根系生长，水稻收割后根系可为土壤细菌提供持久全面的养分和更多的碳源、能源，更利于土壤细菌的生长[27-28]。而旱地与水稻田的土壤类型不同可能是导致施氮造成不同影响的主要原因[23]。

施氮改变了细菌的多样性指数，但不同氮水平对其影响并不一致。王佩雯等[29]研究发现，烟草连作条件下土壤细菌群落多样性对施肥的响应并不明显，而Zhou等[12]研究发现，长期施用氮肥导致东北黑土土壤微生物多样性降低。周岚等[30]研究发现，低氮与不施氮相比，土壤细菌的多样性及丰富度差异不大，但高氮与低氮及不施氮肥间存在较大差异，说明不同施氮水平对于土壤细菌的多样性及丰富度的影响并不一致，与本研究结果相一致。

3.3 施氮对稻田土壤细菌群落结构的影响

变形菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和放线菌门是三个施氮处理中的优势门类群，所有处理中变形菌门相对丰度均高达40%以上，表明变形菌门有较强的适应能力。Fierer等[31]和Deangelis等[32]的研究推测，变形菌门在各种植物的根际土壤中快速增长是其在各种植物根际微生物中占优势的主要原因。袁红朝等[26]、高圣超等[33]研究结果表明施氮增加变形菌门的相对丰度，而本研究显示施高量氮显著增加变形菌门的相对丰度，但是低氮则略微降低其丰度，这与于海玲[34]的研究相一致。硝化螺旋菌门是一种与生物固氮相关的细菌，本研究中，硝化螺旋菌门对于氮肥的响应与变形菌门一致。此外，酸杆菌门在本研究中也是优势菌落，这与前人[15]研究结果相一致，且酸杆菌门的活性与土壤pH密切相关[31]，而本研究结果显示，施低量氮略微增加了酸杆菌门的相对丰度，而高氮则显著降低其丰度，这与王伏伟等[35]研究结果相一致，表明土壤中酸杆菌门不仅受到土壤pH的影响，还可能与其他理化性质存在一定的关系[36]。土壤中的放线菌门能够加速动植物残体的分解，同时在氮循环过程中也发挥着一定的作用[37]。本研究结果显示，施氮显著增加放线菌门的相对丰度，且放线菌门与土壤全氮呈显著正相关，这与王伏伟等[35]研究相一致。

李妙婉[38]发现厌氧绳菌属和硝化螺旋菌属是曝气生物滤池处理污水过程中的优势微生物群落，与本研究结果相一致，可见厌氧绳菌属和硝化螺旋菌属有着极强的适应能力，可适应不同生态环境。此外，相关性分析显示11个优势门水平菌群均与土壤化学性质存在显著相关性。这与袁红朝等[26]、高圣超等[33]、秦杰等[14]的研究结果相一致，施肥是导致土壤中微生物结构与数量改变的主要原因之一。本研究仅对双季稻种植制度冬闲期的土壤微生物进行了研究，缺少早稻季及晚稻季土壤微生物对氮肥响应的研究，今后将更加系统地对双季稻系统土壤微生物进行研究。