紫外—可见分光光度法测定乌灵胶囊总黄酮含量的方法研究

郭慧玲， 张亚军

（内蒙古医科大学附属医院药局，内蒙古呼和浩特 010050）

乌灵胶囊是从我国珍稀药用真菌乌灵参中分离获得的菌种，经现代生物工程技术精制而成的纯中药制剂。乌灵参是生长在土栖白蚁巢中的一种真菌的菌核，据《四川中药志》记载，乌灵参（Xylariasp）具有利尿、补心神、治失眠、吐血及产后失血等药用价值[1]。乌灵胶囊收载于《中国药典》2010年版一部，具有补肾健脑、养心安神的功效，临床用于心肾不交所致的失眠、健忘、心烦心悸、神疲乏力、腰膝酸软、头晕耳鸣、少气懒言、脉细或沉无力等[2]。乌灵胶囊含有腺苷、腺嘌呤、尿苷、鸟苷、多糖、甘露醇、麦角甾醇、胆甾醇、β-谷甾醇及门冬氨酸、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、赖氨酸等19种氨基酸（其中9种必需氨基酸），此外还含有铁、锌、锰、铜、磷、镁、钙、锗和维生素（B1、B2、B6、E、A、D2、K1）等多种成分[3]。但对乌灵胶囊中所含有的具有广泛生理效应（如抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛、抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤[4-8]）的总黄酮的研究尚未见文献报道，为此本课题组在其总黄酮含量测定方面做了相应的研究，以期为乌灵胶囊的二次开发提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；10 000 r/min TGL-16C型离心机（上海安亭科学仪器厂）；5 000 r/min L-5-型离心机（海安亭科学仪器厂）；V2550型紫外分光光度计（日本岛津）；XMTD-204型数显恒温水浴锅（金坛市国旺实验仪器厂）；R-201型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）。

1.2 样品与试剂 乌灵胶囊（浙江佐力药业股份有限公司，批号：20170707、20170708、20170709）。体积分数95%乙醇（CH3CH2OH，浙江三鹰化学试剂有限公司产品）；无水乙醇（杭州大方化学试剂厂产品）；氢氧化钠（NaOH，河南尔康制药有限公司产品）；亚硝酸钠（NaNO2，天津博迪化工股份有限公司产品）；硝酸铝[Al（NO3）3，上海振欣试剂厂]；甲醇（CH3OH，天津博迪化工股份有限公司产品）；氯化氢（HCl，浙江三鹰化学试剂有限公司产品）；镁粉（上海精化科技研究所产品）；三氯化铝（AlCl3，常州市振安化工有限公司产品）；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，规格：100 mg/支，批号：100080-201207）；培养基（浙江佐力药业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 测定方法及测定波长选择

2.1.1 AlCl3显色法（A法） 吸取供试品溶液0.4 mL，置于25 mL容量瓶中，加4%的AlCl3甲醇液0.5 mL，加甲醇至刻度，摇匀，静置40 min；以相应试剂为参比，在波长200～600 nm范围内扫描，测定波长最大吸收。结果在350 nm处有最大吸收，但极不稳定。测未显色供试液（以相应试剂为参比），在波长200～600 nm范围内扫描，测定波长最大吸收。在350 nm处无最大吸收。通过以上比较分析认为，本法不适用于乌灵胶囊中总黄酮的含量测定。

2.1.2 盐酸—镁粉显色法（B法） 供试品溶液（乌灵提取液），吸取对照品溶液、供试品稀释液2 mL，分别置加有200 mg镁粉的25 mL具塞比色管中。各加体积分数60%乙醇至3 mL，摇匀，将比色管置于10～15℃冷水浴中。缓慢滴加浓HCl 2 mL并不时振摇，盖塞摇匀，沸水浴中加热1 h，迅速冷却至室温。加体积分数60%乙醇至5 mL刻线，摇匀，静置20 min。以相应试剂为空白，在200～600 nm范围内扫描。结果显色后在285 nm处有最大吸收，但未显色的供试品溶液、对照品溶液在280 nm处有吸收，可以形成干扰，故本法不适用于乌灵胶囊中黄酮的含量测定。

2.1.3 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法（C法）供试品溶液3.0 mL，置于25 mL容量瓶中。加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min；加 4%NaOH溶液10.0 mL，体积分数60%乙醇定容，摇匀。10 000 r/min离心20 min，在波长400～700 nm范围内扫描。结果在510 nm处有最大吸收峰。以相应试剂为空白，在波长400～700 nm范围内扫描，510 nm附近未见吸收峰。

综上，A、B 2种常用的总黄酮含量测定方法不适用于乌灵胶囊，C法较适合，确定测定波长为510 nm。

2.2 制作标准曲线

2.2.1 对照品溶液制备 准确称取芦丁标准品5.500 2 mg，用体积分数60%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，作为标准液备用。

2.2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取芦丁对照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中。加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加10%A1（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；加4%NaOH溶液4 mL，再用体积分数60%乙醇液稀释至刻度，摇匀。10 000 r/min离心20 min；置比色皿中，以没有加芦丁对照品溶液的其他试剂作空白参比。于510 nm处测吸光度（D），得回归方程：Y=0.013 0 X-0.017 6，R2=0.999 7，表明在5.5 ～ 55 μg·mL-1范围内线性关系良好。见图1。

图1 芦丁标准曲线Figure 1 Standard curve of rutin

2.3 提取条件考察 为系统考察乙醇提取法的工艺参数，根据文献资料[9，10]及实际情况，对首次提取条件进行优选。选用乙醇浓度（A）、溶剂用量（B）、提取时间（C）、提取温度（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量（质量分数）为考察指标，选用L9（34）正交表设计（注：乌灵胶囊中乌灵菌粉用量为10 g）。见表1、2。

从表2的直观分析可知，4种因素对乌灵胶囊总黄酮提取结果影响大小依次为D＞B＞A＞C。3种因素的最佳组合为A3B2C3D2，因此，乌灵胶囊总黄酮的最优提取条件为：在85℃水浴条件下，用体积分数90%乙醇100 mL水浴回流提取2 h。

2.4 测定

2.4.1 供试品溶液制备 精密称取乌灵胶囊约3 g，加体积分数90%乙醇100 mL，先泡0.5 h，85℃水浴条件下回流提取2 h，抽滤。按同法再提取1次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇至仅剩5～7 mL为止，置于100 mL容量瓶中，用体积分数60%乙醇稀释至刻度，得样品液。

2.4.2 仪器精密度考察 取按“2.4.1”项供试品溶液的制备，制备供试品溶液。取同一份对照品溶液，按照“2.1.3”项显色法进行显色，连续6次测定吸光度，分别为0.167、0.167、0.167、0.166、0.166、0.166，相对标准偏差（sR）=0.329%，表明仪器精密度良好。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels for orthogonal test

表2 L9（34）正交试验设计及结果Table 2The results for L9（34）orthogonal test

2.4.3 显色稳定性考察 取同一份对照品溶液，按照“2.1.3”项显色法进行显色，显色后以10 000 r/min 离心 20 min 后于 0、10、20、30、40、50、60 min时测定吸光度，结果表明显色后20～80 min吸光度稳定。见表3。

2.4.4 重复性考察 精密称取过60目乌灵胶囊内容物3 g共6份，按“2.4.1”项供试品溶液制备方法制备，按照“2.1.3”项显色法进行显色，测定510 nm处吸光度并计算含量，平均含量为0.842 mg/g，sR为2.309%，说明该方法重复性良好。见表4。

2.4.5 加样回收率考察 精密吸取2.5 mL乌灵胶囊内容物提取液（含总黄酮0.075 mg）于10 mL容量瓶中，加入与样品中总黄酮含量相等的芦丁参照品。加0.3 mL 5%NaNO2，摇匀后静置6 min；加0.3 mL Al（NO3）3，摇匀后静置6 min；加4%NaOH4 mL摇匀后静置6 min。加体积分数60%乙醇补足至刻度，1 000 r/min离心20 min。于510 nm处测定吸光度值，并求得其平均回收率为99.420%，sR为1.270%，结果见表5。结果表明，紫外分光光度法测定总黄酮含量，方法可靠，定量准确。

表3 显色稳定性考察表Table 3 The stability results for color-developing system

表4 乌灵胶囊总黄酮含量测定重复性考察表Table 4 The repeatability results for determination of content of total flavonoids in Wuling Capsules

2.5 乌灵胶囊总黄酮含量测定 按照经过研究确定的样品提取方法、显色方法、测定方法进行操作，对乌灵胶囊进行总黄酮含量测定，结果显示：乌灵胶囊总黄酮质量分数为1.021 mg/g。见表6。

2.6 乌灵胶囊内容物培养基总黄酮含量测定 按照经过研究确定的样品提取方法、显色方法、测定方法进行操作，对培养基进行总黄酮含量测定，结果显示：总黄酮质量分数为0.191 mg/g。见表7。

2.7 3批乌灵胶囊总黄酮含量测定 按照经过研究确定的样品提取方法、显色方法、测定方法进行操作，对3个批次的乌灵胶囊进行总黄酮含量测定，实验结果显示：乌灵胶囊（20170707、20170708、20170709）总黄酮质量分数分别为0.967、0.936、0.831 mg/g。见表8。

表5 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法的回收率试验结果Table 5The test results for recovery rate by NaNO2-Al（NO3）3-NaOH colorimetric assay

表6 乌灵胶囊总黄酮含量测定结果Table 6 The content of total flavonoids in Wuling Capsules

表7 乌灵胶囊内容物培养基总黄酮含量测定结果Table 7 The content of total flavonoids in medium of Wuling Capsules

表8 3批乌灵胶囊总黄酮含量测定结果Table 8 The content of total flavonoids in 3 batches of Wuling Capsules

3 讨论

黄酮类化合物普遍存在于植物中，以与糖结合为苷或游离态的方式存在，是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化和还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。根据三碳键（C3）结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇、二氢黄酮和黄烷酮醇二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查耳酮、二氢查耳酮、橙酮（又称澳咔）、黄烷和黄烷醇、黄烷二醇（3，4）（又称白花色苷元）。黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降血糖、降血脂、提高免疫力等作用[11-15]。基于黄酮类化合物的这些广泛作用，我们对乌灵胶囊中的总黄酮进行研究，通过开发其在补肾健脑、养心安神之外的其他功能，以增加乌灵胶囊的适应症，或将其开发成为其他剂型的制剂。

本研究以乌灵胶囊中黄酮类化合物的提取率为指标，探讨了乙醇浓度、提取时间、提取温度和溶剂用量等4个因素对灵芝菌糠中黄酮类化合物提取率的影响，并在单因素试验的基础上，设计了L9（34）正交试验以对提取工艺进行优化。研究结果显示，在乙醇浓度（90%）、溶剂用量、提取时间（2 h）、提取温度（85℃）的条件下，乌灵胶囊中黄酮类化合物的提取率最高。

本研究应用AlCl3显色法、盐酸—镁粉显色法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法这3种紫外分光光度法在200～600 nm波长范围内进行扫描。结果显示，AlCl3显色法在350 nm处有最大吸收，但极不稳定。盐酸—镁粉显色法显色后在285 nm处有最大吸收，但未显色的供试品溶液、对照品溶液在280 nm处有吸收，可形成干扰，因此这2种方法均不可以用于乌灵胶囊中总黄酮的含量测定。而采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法，芦丁对照品和乌灵胶囊提取的总黄酮均在510 nm波长处有最大吸收。其基本原理为黄酮类化合物在中性或弱碱性条件下能够与铝盐形成黄色络合物，继续加入氢氧化钠会生成桔红色有机物，在可见光区510 nm波长附近产生最大吸收[16]，从而为紫外分光光度法测定提供了可靠的依据。故本研究选择该方法作为乌灵胶囊提取物中总黄酮含量的检测方法，结果表明其方法可行、准确、简捷，重复性和稳定性良好，可以用于乌灵胶囊中总黄酮的含量测定。

在本研究中还发现，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定总黄酮含量时，必须严格保证稀释定容用乙醇的浓度一定要准确，对试剂加入时间、显色时间各步操作中每个样品最好是平行进行，以确保测试环节前后完全一致，否则会出现很大误差。

总黄酮含量测定的方法主要包括NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法[17]、AlCl3[18]显色法和盐酸—镁粉[19，20]显色法。由于当黄酮化合物的B环中不存在 3’，4’-邻位二酚羟基的结构时，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系是无法显色的[21]。而本研究发现，乌灵胶囊中总黄酮是显色的，因此可以推断其总黄酮结构中存在3’，4’-邻位二酚羟基；而黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇均易在盐酸—镁粉作用下被还原，生成橙红到红紫色物质，故推断乌灵胶囊中总黄酮中并不含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类物质。AlCl3显色法[22]反应主要发生在3-羟基、4-羰基和邻二酚羟基，只存在5-羟基、4-羰基的黄酮类物质与AlCl3不发生反应，由此推断，乌灵胶囊总黄酮是5-羟基、4-羰基的黄酮类物质。通过本研究可以为有目的地合成与乌灵胶囊总黄酮有关的黄酮类物提供依据。

本研究发现，当培养基通过乌灵菌在一定条件进行发酵后，其产物中总黄酮含量是培养基中的5倍有余，这更进一步证明，乌灵胶囊中总黄酮是其产物药效的有效物质基础，对其研究还有待进一步深入。