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金翘片体内抗甲型H3N2流感病毒及禽流感病毒H9N2作用研究

2019-07-12张美义何家靖杨子峰杨兆丽杨家庆詹利之曾庆慕冯丽玲李国桥朱宇同

广州中医药大学学报 2019年7期
关键词:银翘生药流感病毒

张美义, 何家靖, 杨子峰, 杨兆丽, 杨家庆, 詹利之,曾庆慕, 冯丽玲, 李国桥, 朱宇同

(1.广州中医药大学热带医学研究所,广东广州 510405;2.广州医科大学广州呼吸道疾病研究所,广东广州 510000)

金翘片是由金银花、连翘、牛蒡子、甘草等9味中药组成的复方制剂,具有疏风解表、清热解毒的功效。前期经体内研究[1]证实:金翘片具有显著的抗甲型H1N1流感病毒作用,能够明显抑制H1N1流感病毒导致的小鼠肺指数升高,提高死亡保护率和生命延长率,降低肺组织的病毒载量,提高γ干扰素(γ-IFN)水平(P<0.05或P<0.01)。本研究进一步探讨了金翘片对甲型H3N2流感病毒及禽流感病毒H9N2的作用,现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物 金翘片由广州中医药大学青蒿研究中心药学研究室提供,批号:070801、120501;给药前用无菌蒸馏水配制成所需质量浓度。利巴韦林(Rib.),由广东肇庆星湖生物化学制药厂生产,批号:L051075。银翘解毒片由北京同仁堂科技发展公司制药厂生产,批号:0124432。阿司匹林肠溶片为湖南新汇制药有限公司产品,批号:09115。罗通定为四川金药师制药有限公司产品,批号:090401。

1.2 动物 NIH小鼠,雌雄各半,体质量13~15 g,SPF级,由广东省医学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(粤)2008-0002。SD大鼠,雌雄不拘,体质量160~190 g,SPF级,由广东省医学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(粤)2008-0002。饲养环境:室温(23±2)℃,相对湿度为(75±10)%,喂以标准鼠类块料,自由饮用蒸馏水。

1.3 病毒株 甲型H3N2流感病毒鼠肺适应株,由中国药品生物制品检定所提供,经鸡胚尿囊腔传代增强毒力后,测定其半数致死量(LD50=10-3.50)(为20120717病毒液)。禽流感病毒H9N2鼠肺适应株,由华南农业大学兽医学院药理教研室提供,经鸡尿胚囊腔传代增强毒力后,以鸡红血细胞血凝来判断其滴度,并测定半数致死量LD50为10-3.70。分装封盖,置-80℃冰箱冻存备用。本实验主要工作在广州中医药大学原虫与病毒实验室完成。

1.4 主要试剂与仪器 无水乙醚(广州化学试剂厂)。JD200-3型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);T500型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)。

1.5 动物分组[2]甲型H3N2流感病毒模型:将小鼠随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组(剂量为75 mg/kg)、金翘片组[070801与120501共2批,低、中、高剂量分别为0.610、1.220、2.440 g(生药)/kg],共9组,每组10只。利巴韦林组和金翘片不同剂量组给予相应剂量药物,正常对照组、病毒对照组给予等体积蒸馏水。除正常对照组外,其他各组小鼠在乙醚轻度麻醉下,以15 LD50病毒液滴鼻感染,每只0.2 mL。于感染前1 d开始灌胃给药,每天1次,每次0.2 mL/10 g(体质量),连续5 d。

禽流感病毒H9N2模型:将小鼠随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组(剂量为75 mg/kg)和金翘片组[剂量为0.30 g(生药)/kg]共4组,每组6~9只。各组给药方式同H3N2模型,其中以15 LD50病毒液滴鼻感染,每只0.05 mL。灌胃给药每次0.1 mL/10 g(体质量),连续5 d。

1.6 金翘片对流感病毒感染小鼠胸腺的影响 给药结束后,取出胸腺,称质量,计算胸腺指数。胸腺指数(%)=胸腺质量(mg)/体质量(g)×100%。

1.7 金翘片对流感病毒感染小鼠肺病变的影响 给药结束后第2天,禁食禁水4 h以上,称体质量,处死,取出全肺,记录病变程度;于生理盐水中洗涤2次,用吸水纸吸干表面水分,称肺质量,计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数(%)=肺质量(g)/体质量(g)×100%。肺指数抑制率(%)=(病毒对照组肺指数均数-用药组肺指数均数)/病毒对照组肺指数均数×100%。

1.8 金翘片的解热、镇痛、抗炎作用

1.8.1 对干酵母所致大鼠发热的解热作用[2]取大鼠60只,体质量160~190g,将大鼠随机分为6组,即生理盐水组、银翘解毒片组[1.12 g(生药)/kg]、金翘片组[低、中、高剂量分别为0.305、0.610、1.220 g(生药)/kg]、阿司匹林组(0.1 g/kg),每组10只。致热前各组大鼠禁食(不禁水)8 h,然后按前述剂量各组给药1次。给药后立即给予大鼠背部皮下注射20%酵母悬液10 mL/kg致热,于致热后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h各测大鼠体温1次。

1.8.2 对小鼠热板致痛的影响[2]采用小鼠热板法,控制实验温度为18℃,热板温度为(55±0.5)℃。以小鼠放于热板上后出现舔足所需时间作为痛阈值。取痛阈合格(5~30 s)雌性NIH小鼠72只随机分为6组,即生理盐水组、银翘解毒片组[2.24 g(生药)/kg]、金翘片组[低、中、高剂量分别为0.610、1.220、2.440 g(生药)/kg]、罗通定组(30 mg/kg)。每组12只。测定用药前、用药后0、30、60、90 min的小鼠痛阈值。

1.8.3 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响[2]取大鼠60只,体质量160~190 g,将大鼠随机分为6组,即生理盐水组、银翘解毒片组[1.12 g(生药)/kg]、金翘片组[低、中、高剂量分别为0.305、0.610、1.220 g(生药)/kg]、阿司匹林组(0.1 g/kg),每组10只。以1%的角叉菜为致炎剂,分别在大鼠右后肢足跖皮下注射0.1 mL。致炎前测定各组大鼠右后跖的正常体积,致炎后0、1、2、3、4、5、6 h再测定各组大鼠右后跖的体积。记录结果,按下式计算肿胀率:肿胀率(%)=[(致炎后足跖容积-致炎前足跖容积)/致炎前足跖容积](100%。

1.9 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(-x±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金翘片对甲型H3N2流感病毒感染鼠肺病变的抑制作用 表1~3结果显示,在本次实验条件下,病毒对照组肺指数为2.030,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),说明造模成功。利巴韦林肺指数抑制率为62.3%,具有明显的抑制肺病变作用。2批金翘片(070801、120501)肺指数抑制率介于35.7%~54.3%,均具有明显的抑制肺病变作用,量效关系明显,且对小鼠体质量及胸腺均无明显的抑制作用。

2.2 金翘片对禽流感病毒H9N2感染鼠肺病变的抑制作用 表4结果显示,明金翘片对禽流感病毒H9N2具有较显著的抑制作用。

表1 各组小鼠体质量变化情况比较Table 1 Comparison of the body mass of mice in various groups (-x±s)

表2 各组小鼠肺指数比较Table 2 Comparison of the lung index in mice of various groups

表3 各组小鼠胸腺指数比较Table 3 Comparison of the thymus index in mice of various groups (-x±s)

2.3 金翘片的解热作用 表5结果表明,给药后2 h金翘片明显抑制大鼠体温升高并持续至10 h(P<0.05或P<0.01),起效快,且持续时间长,而相同剂量的银翘解毒片[1.22 g(生药)/kg]仅在8~10 h表现较明显的体温抑制作用,且持续时间较短。

表4 各组小鼠肺指数比较Table 4 Comparison of the lung index in mice of various groups

2.4 金翘片的镇痛作用 表6结果表明,给药后金翘片能明显提高小鼠痛阈值,明显提高小鼠痛阈百分率(P<0.05或P<0.01),持续90 min,镇痛作用强于同剂量银翘解毒片(P<0.05)。

2.5 金翘片的抗炎作用 表7结果表明,生药剂量为0.610~1.220 g/kg的金翘片在致炎后3 h开始明显抑制足跖肿胀(P<0.05或P<0.01),而银翘解毒片在致炎后4 h开始发挥作用,强度弱于金翘片。

表5 金翘片对干酵母所致大鼠体温的影响Table 5 Effect of Jinqiao Tablets on temperature alternation in rats induced by dry yeast (-x±s)

表6 金翘片对小鼠热板法痛阈的影响Table 6 Effect of Jinqiao Tablets on hot-plate induced pain threshold in mice (-x±s)

表7 金翘片对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响Table 7 Effect of Jinqiao Tablets on carrageenan-induced pedal swelling in rats (-x±s)

3 讨论

流感病毒的不断流行主要在于病毒表面的2种糖蛋白抗原—血球凝集素(hemagglutinin,H)和神经氨酸酶(neuraminidase,N)的不断进化。由于H和N抗原容易变化而产生新的亚型,此时人类往往对新亚型的免疫力不强而引起不同程度的流行。H3N2型流感1968年首次在香港发生[3],但和H1N1、H7N9等类似,至今仍然是人群中流行的主要流感亚型。H9N2亚型禽流感病毒可以感染人,同时还是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等感染人的流感病毒的内部基因的供体[4]。

中医药治疗病毒性感染疾病具有独特优势,不仅疗效确切,耐药性低,副作用和不良反应少,还有抑菌、抗病毒、解热镇痛、免疫调节等标本兼治的综合功效[5]。中草药抗流感病毒主要有2条途径:直接灭活或抑制病毒和通过诱生干扰素或调节人体免疫功能而间接抗病毒[6]。由于前期的研究表明金翘片具有明显的抗H1N1流感病毒作用,其作用明显强于同等剂量下的银翘解毒片及莲花清瘟胶囊,甚至相当于化学药达菲,这与复方中某些具有突出抗病毒作用的药味及本复方成型采用的工艺是密切相关的。一般药理研究表明,金翘片同时具有显著的解热、镇痛、抗炎作用,这对于解除流感所致的发热、咳嗽、咽痛等具有重要作用。文献研究发现,目前已上市的莲花清瘟胶囊(片/颗粒)、金花清感颗粒等抗感冒中药复方尚未有关于抗禽流感病毒H9N2方面的研究报道。本研究结果显示,本研究通过扩大试验病毒种类,进一步证实了金翘片同时具有一定的抗甲型H3N2流感病毒及抗禽流感病毒H9N2作用。

(同等贡献作者:李国桥,张美义,何家靖,杨兆丽,杨子峰)

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