乳酸菌作为基因工程菌的研究进展

黄佳明， 姜 宁， 张爱忠

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319）

乳酸菌是一类能从碳水化合物中产生大量乳酸的一类细菌的总称。常见的菌属包括：乳酸杆菌属、双歧杆菌属、乳酸乳球菌和链球菌属等。乳酸菌是全球公认安全级的微生物，不具有致病性，也是益生菌的一种，有诸多的益生功能。随着基因工程技术的发展，通过引入新基因实现其在工程菌中的表达，达到改变其代谢功能或表达出一些功能性蛋白的目的，如抗菌肽等。应用基因工程技术改进现有菌株或开发新菌株是目前研究领域的热点。随着食品技术的发展以及对健康要求的改变，采用食品级的乳酸菌作为基因工程宿主菌引起研究者的广泛关注。

1 作为工程菌的生物学功能

乳酸菌作为工程菌是因为其表现出的众多的优势。首先，与其他宿主菌相比，本身不产生内毒素，而且免去了分泌蛋白后期的分离纯化步骤，可以直接实现活体菌株的饲喂。其次，由于分子生物学以及遗传学的进步和发展，对乳酸菌有了更深层次的研究，对乳酸菌质粒基因的具体构造和功能的进一步了解，以及乳酸菌基因测序工作的完成（Altermann等，2005），推动了乳酸菌在基因工程技术上的应用。除此之外，乳酸菌具有黏附与定植功能，乳酸菌是有益菌，在人和动物肠道中广泛存在，增加对乳酸菌的摄入，可以改善动物胃肠道的内环境，也可间接减少有害菌的数量，增加食物的消化率。另外，有研究表明乳酸菌可以增强肠道屏障功能，肠道黏液有着抗炎症和抗感染的功能，其可作为肠道的屏障，Ren（2018）等研究了乳酸菌对参与肠道黏液合成的杯状细胞相关基因的影响，证明了其可以增强相关基因的表达，以及对损伤的杯状细胞有一定的修复作用，也证明了其可提高肠道黏膜的修复和再生功能。乳酸菌还具有杀菌作用，乳酸菌可分泌一些有机酸，有机酸本身就有一定的抑菌能力，还能解离出H＋，引起病原体表面膜电位的变化，进而使细菌死亡（Gálvez等，2014），也间接降低了环境的pH，抑制了有害菌生长。乳酸菌本身能分泌一些抗菌物质，对有害菌有一定的杀伤能力，如细菌素等。

2 基因工程宿主菌

2.1 乳酸乳球菌 乳酸乳球菌生长快，代谢简单，基因组包含足够的生物学信息，是安全级的微生物。自身不分泌蛋白酶，降低了外源蛋白被降解的风险。本身不分泌内毒素，也不产生任何的有毒物质，不会产生像大肠杆菌那样的包涵体结构，基因组小自身分泌的蛋白质少，也有利于外源蛋白的分离纯化。近年来，随着电转化技术的进一步发展，各种表达载体和克隆载体的建立，以及根据乳酸菌的自身特性发明的多种诱导系统，使得乳球菌作为基因工程宿主菌被广泛地研究。从表1可以看出，乳酸乳球菌近年来作为基因工程宿主菌的研究主要集中在作为口服疫的应用上，基因ORF 6是猪繁殖和呼吸综合征病毒基因，基因VP2是鸡传染病性法氏囊病毒的主要抗原蛋白，基因S1是通过PCR猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)的抗原蛋白基因得到的，基因DerP2是由尘螨引起的过敏性哮喘的过敏原基因，实现了各种病毒的免疫性抗原基因或抗原基因的衍生物在乳酸乳球菌中的表达。为由病毒引起的疾病动物提供了一种有效的治疗手段。

表1 异源基因在乳球菌中的表达

2.2 乳酸杆菌 乳酸杆菌主要存在于人和动物的胃肠道中，是一种有益菌，在肠道中定植，有着诸多的益生功能。有研究发现，已经实现了各种乳酸杆菌中质粒的分离（Chassy等，1978)。虽然到目前为止，乳酸杆菌的研究没有像乳球菌那么深入，但也已从乳酸杆菌中分离出了各种用于表达和翻译的调控元件。随着乳酸菌测序技术的完成，将其作为宿主菌的研究也越来越广泛。由于乳酸杆菌相对于乳球菌作为宿主菌的研究起步较晚，所以直到现在乳酸杆菌还没有食品级的表达载体，应用的主要是由红霉素或氯霉素等抗生素基因标记的非食品级的表达载体。由表2中可以看出，乳酸杆菌中的干酪乳杆菌作为宿主菌得到了广泛的应用，主要表达的是引起动物产生疾病的病毒抗原蛋白基因，将含有抗原基因的重组菌株通过口服或注射的方式导入动物体内来间接引起动物产生免疫性反应。除此之外，由于乳酸杆菌可以实现在动物肠道中的定植和黏附，可以在乳酸杆菌中表达一些功能性蛋白，比如将抗菌肽以及一些酶制剂的基因导入乳酸杆菌，将重组菌株直接饲喂动物，这样不仅减少了表达产物后期分离纯化的麻烦，还可以实现功能性药物在动物胃肠道源源不断的产生，持续发挥作用的目的。

表2 异源基因在乳酸杆菌中的表达

2.3 双歧杆菌 双歧杆菌是从人的粪便中分离出来的一种革兰氏阳性杆菌，广泛存在与人和动物肠道中以及口腔中，其有诸多的益生功能，可以维持肠道菌群平衡以及机体的免疫调节，对动物的腹泻有着很好的治疗作用。从表3可以看出，虽然双歧杆菌实现了多种外源基因的表达，但对其的研究还不够深入，到目前为止，双歧杆菌还没有一套成型的表达系统。主要原因有两个，一个是对其的研究较晚，2002年才实现基因的测序工作（Schell等，2002），另一重要的原因是双歧杆菌中存在质粒的菌株较少，有研究表明，在32株双歧杆菌中仅有五株发现了有质粒的存在，这些使双歧杆菌作为表达系统发展缓慢。但双歧杆菌有着清楚的遗传背景，随着基因技术的发展，可以实现对双歧杆菌的内部改造，达到让其作为优秀工程菌的目的。其本身作为安全级微生物，以及具有可以在动物肠道中定植的特性，使双歧杆菌有着很好的开发和应用前景。

3 基因工程乳酸菌的应用

3.1 在疫苗领域中的应用 乳酸菌可以在黏膜系统黏附以及人和动物肠道中定植，使其在疫苗的开发及应用上引起了人们的关注。目前基因工程乳酸菌在疫苗中的应用主要是作为疫苗的传递载体，已经证明乳酸菌可以有效的在黏膜系统中传递，其克服了将功能性蛋白质传递到黏膜组织的问题。通过鼻内途径，证明了活的和杀死的乳酸菌疫苗菌株都能引起黏膜和全身免疫反应。Wells（2011）研究表明，乳酸菌作为黏膜传递系统的可行性，这种新的传递系统已清楚地显示出乳酸菌疫苗的免疫原性和保护性免疫的潜力。此外，乳酸乳球菌口服给药可诱导抗原特异性口服耐受（OT）分泌重组抗原。与纯化的抗原相比，乳酸菌作为传递疫苗在诱导OT方面更有效，这就避免了纯化大量抗原的需要。这种方法在过敏反应和抗原诱导的自身免疫性疾病中具有治疗和干预作用。花生过敏（PNA）已成为世界范围内不可忽视的健康问题。迄今为止，诱导黏膜耐受的过敏原特异性免疫治疗已被广泛认为是PNA的主要治疗策略。乳酸菌的安全特性和固有的益生菌特性使它们成为黏膜疫苗的有吸引力的递送载体。Ren等（2014）利用转基因乳酸乳球菌，通过不同的蛋白靶向系统产生花生过敏原Ara h 2，并观察其对小鼠过敏性免疫反应的免疫调节作用。研究表明，与表达Ara h 2（LL1)胞质形式的菌株相比，表达Ara h 2（LL2和LL3)的分泌和锚定形式的菌株在将Th2极化重新导向非过敏性Th1免疫应答方面更有效。通过口服重组乳酸链球菌，还可以在局部水平观察到SIgA和调节性T细胞的诱导。通过鼻内注射（IN）途径注射流感疫苗与常规肌肉注射相比更有吸引力。这表明，给药的方式不仅仅只是一种形式，还具有一定的优势，除了全身抗体外，还有诱导局部保护性抗体的潜力，即S-IgA。Berlec等（2012)探索了在小鼠鼻内免疫后诱导保护性抗体应答中使用安全的佐剂系统。用乳酸乳球菌食品级的细菌抗原颗粒（BLPs)感染小鼠，研究发现，用BLPs疫苗免疫的小鼠，与没用疫苗免疫的小鼠相比，在被同源或异源的病毒攻击时被感染的机率显著降低。证明了用BLPs佐剂接种的流感疫苗可有效增强全身和局部抗体应答，对同源和异源病毒的感染有着显著的保护作用。

表3 异源基因在双歧杆菌中的表达

3.2 在饲养领域的应用 基因工程乳酸菌在养殖领域也有着广阔的应用前景，首先乳酸菌本身添加到饲料中就可以改变饲料的品质，提高饲料的消化率。其次如果将纤维素酶基因和淀粉酶基因通过基因工程手段实现在乳酸菌中的表达，这样的乳酸菌用于青贮饲料，在乳酸菌作用的基础上，还能分泌一些蛋白酶和淀粉酶，可以提高纤维素的降解率，有助于动物的消化。高云航等（2015)设计合成的纤维素酶基因导入乳酸菌中，经诱导表达，得到了对纤维素具有分解活性的表达蛋白，酶活力为0.57 U/mL。王艳（2017)将多黏类芽孢杆菌纤维素基因导入乳酸菌中，成功获得了具有分泌能力的重组乳酸菌。证明了重组乳酸菌在饲料领域有着很好的发展前景，其在动物中也有很好的应用，刚出生的仔猪其消化道与肠道发育不完全，肠道菌群没有定型，消化不良和肠道菌群功能紊乱引起的疾病使仔猪有着较高的死亡率。将基因工程的乳酸菌饲喂仔猪可以在一定程度上改善这个问题。尹清强等（2006)将淀粉酶基因导入到猪的消化道乳酸菌中，将重组菌株饲喂仔猪，不仅弥补了仔猪肠道菌群的内环境问题，同时表达的淀粉酶在肠道中实现分泌，也间接缓解了淀粉酶在仔猪肠道中分泌不足问题。在动物中的另一个应用是构建疫苗载体，如将一些引起动物产生疾病的病毒的抗原基因在乳酸菌中表达，重组菌种作为活体疫苗饲喂动物，这样可以取得很好的防治效果。

4 小结与展望

随着基因工程技术的发展，乳酸菌表达系统已经实现了在多个领域的应用。通过基因工程改造的乳酸菌有着更为广泛的应用前景。目前已经在微生态制剂、药品、活菌疫苗、饲料添加剂等多个领域应用。但乳酸菌作为工程菌还存在一些需要解决的难题。首先就是大多数表达系统中的载体和标记基因不是“食品级”的,“食品级”的应用较少，存在安全隐患。其次乳酸菌在动物肠道中定植存在耐受问题。最后就是乳酸菌表达外源基因的表达量不是很理想，对功能性蛋白的表达研究也较少。这不仅是乳酸菌作为基因工程菌所存在的问题，也是基因工程菌这个系统所面临的问题。乳酸菌是安全级微生物，必是未来发展的热点。