GeneXpert MTB/RIF对涂阴疑似肺结核及利福平耐药性检测的价值

周银发 李燕平 魏淑贞 林淑芳 赵永 郑建莉 林建 张山鹰

结核病是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道传染病，2018年WHO[1]估计全球2017年有1000万例结核病发病患者，中国占9%，位居全球第二；全球估计新发耐多药和利福平耐药结核病(multidrug and rifampicin-resistant tuberculosis, MDR/RR-TB)患者55.8万例，中国占13%，是30个MDR/RR-TB高负担国家之一。因此，早期发现和治疗肺结核患者对于控制结核病传播具有重要意义。目前，多数结核病防治机构(简称“结防机构”)主要依靠痰涂片镜检来筛查肺结核，虽然该方法快速、廉价，但由于留痰、涂片及镜检过程中受到各种因素的影响，导致分枝杆菌检出率低，涂片阴性患者较多，易造成误诊漏诊，延误患者诊治。痰培养尽管能提高分枝杆菌检出率，但存在检测时间长、操作复杂、技术要求高等缺点[2]。而GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)是基于半巢式实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的全自动MTB检测系统，整个流程在2.5 h内即可完成，并可同时检测是否对利福平耐药。本研究通过回顾性对比GeneXpert与传统痰固体培养(简称“痰培养”)及比例法药物敏感性试验(简称“比例法药敏试验”)对涂阴疑似肺结核患者的检测结果，评价GeneXpert在涂阴疑似肺结核患者诊断及RR-TB 检测中的价值。

材料和方法

1.资料来源：查阅2018年龙岩市各县(区)结核病定点医院及市疾病预防控制中心(简称“CDC”)实验室检测结果登记本(包括痰涂片镜检、MTB痰培养、GeneXpert以及比例法药敏试验检测结果)，并与《结核病管理信息系统》中患者实验室结果比对后，排除结果不一致及肺外结核患者，共收集659例涂阴疑似肺结核患者的实验室检测结果，其中307例行GeneXpert检测，519例行痰培养及菌种鉴定，228例同时进行Xpert检测和痰培养检测。最终622例经临床诊断为涂阴肺结核，纳入同时开展GeneXpert检测与比例法药敏试验检测的肺结核患者101例，排除3例未检出结核感染和1例经临床诊断为非结核与结核分枝杆菌混合感染，最终纳入97例进行统计分析。

2.涂阴疑似肺结核诊断标准[3-4]：具有疑似肺结核影像学表现及3次痰涂片镜检均阴性的患者。根据诊断性抗感染、抗结核治疗或进一步细菌学检测结果可分为以下3类：(1)确诊为涂阴肺结核：进一步细菌学检查结果为分枝杆菌分离培养阳性，或分子生物学检查阳性，或肺组织病理学检查阳性的患者；(2)临床诊断为涂阴肺结核：无细菌学及肺组织病理学检查阳性的诊断证据，但具有肺结核疑似症状或其他辅助检查(结核菌素皮肤试验、γ干扰素释放试验及血清结核抗体检测等)阳性的诊断证据，并且经抗结核药物治疗后有效；(3)其他非肺结核患者：无细菌学或病理学检查阳性结果，经诊断性抗感染或抗结核药物治疗后排除肺结核诊断。

3. 实验室检测方法：(1)痰涂片镜检：按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[5]要求，分别收集每例患者的即时痰、夜间痰及晨痰各一份进行涂片和萋-尼染色显微镜检查，并将剩余的痰标本在24 h内用于痰培养和GeneXpert检测。(2)痰培养：依据《分枝杆菌分离培养标准化程序及质量保证手册》[6]要求，采用酸性罗氏固体培养基进行MTB分离培养。(3)比例法药敏试验：按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化程序及质量保证手册》[7]的要求严格操作。(4)GeneXpert检测：采用Cepheid 公司生产的实时荧光PCR及试剂对患者的痰标本行MTB及RR-TB检测，操作严格按照系统及试剂使用说明书进行。

4.质量控制(简称“质控”)：(1)实验室对每批次染色液均进行质控；每批次酸性罗氏培养基均进行无菌性试验和药敏试验；龙岩市CDC参加国家参比实验室组织的药敏试验熟练度测试历年来均合格通过；每批次的GeneXpert检测试剂盒均设立阳性对照(H37Rv)和阴性对照(水)。(2)将从实验室检测结果登记本数据与《结核病管理信息系统》中的实验室检测结果数据进行比较，排除结果不一致、涂阳以及肺外结核的患者，确保本研究数据的准确性。

5.统计学处理：采用Excel 2016软件收集并整理数据，运用SPSS 24.0软件对数据进行统计学分析，不同方法对MTB检出率(阳性率)的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。一致性检验采用Kappa检验，Kappa值≤0.40时为一致性差，≥0.75为一致性高度一致，介于二者之间为中度一致。

结 果

1.以临床诊断为标准评价GeneXpert 检测的效能：以临床诊断为标准，GeneXpert检测MTB的特异度及阳性预测值与固体培养法一致，均为100.00%；但敏感度(31.40%)高于固体培养法(7.46%)，两种检测方法与临床诊断结果一致性均较差。在涂阴疑似肺结核患者中，GeneXpert对MTB的检出率(29.97%，92/307)明显高于痰培养 (7.13%，37/519) (χ2=76.30，P<0.05)。详见表1。

2.以痰培养为标准判断GeneXpert检测的效能：以痰培养为标准，GeneXpert检出MTB的敏感度与阴性预测值均较高，但特异度与阳性预测值较低，两种检测方法的结果呈中度一致。200例痰培养阴性患者中有46例(23.00%)GeneXpert检出MTB。详见表2。

3. RR-TB检测结果： 纳入同时开展GeneXpert检测与比例法药敏试验检测的患者101例。在比例法阳性患者中，3例GeneXpert未检出结核感染(1例经菌种鉴定为非结核分枝杆菌感染)。另外1例为GeneXpert检出利福平敏感，但比例法检测结果为利福平耐药，且菌种鉴定为非结核分枝杆菌，经临床诊断性治疗确诊该患者为MTB与非结核分枝杆菌混合感染。余97例(初治87例，复治10例)患者经菌种鉴定及GeneXpert检测均确诊为感染MTB，其中GeneXpert检测出利福平耐药患者7例，耐药率为9.28%(7/97)；比例法药敏检测出6例利福平耐药患者，耐药率为6.18%(6/97)；两种方法检测结果一致率较高(98.97%，96/97)，耐药率差异无统计学意义(χ2=0.00，P>0.05)。

表1 两种检测方法以临床诊断为标准的诊断效能判断及比较

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

表2 以固体痰培养为标准Xpert检测MTB的效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

讨 论

肺结核是由于MTB感染肺部引发的慢性呼吸道传染病，细菌学检查是确诊肺结核及RR-TB的重要依据。其传染源主要是痰涂片阳性(涂阳)患者，但有研究表明大约17%的肺结核是由涂阴患者传播引起[8]，而临床上无法从涂阴肺结核患者痰涂片镜检获得细菌学证据，往往需要其他检测手段来获得临床诊断，常因时间较长而影响临床诊治；GeneXpert作为一种操作简便且检出时间短的新型分子生物学检测技术，在早期诊断涂阴肺结核和控制结核病传播具有重要意义[9]。

国内外学者对GeneXpert系统进行了较多的研究，大多集中在涂阳以及痰培养阳性(培阳)结核病患者，其检出MTB的敏感度基本可达97.5%以上，甚至达100.0%[2,10-13]；而针对涂阴或痰培养阴性(培阴)结核病患者MTB检测的研究较少，且报道的结果差别较大，如有文献显示，以传统固体痰培养为金标准，在涂阴疑似肺结核患者中GeneXpert检测MTB的敏感度为55.2%～90.2%[14-15]。而本研究显示，GeneXpert对涂阴疑似肺结核患者检测MTB的敏感度为90.32%，略高于文献报道的敏感度，但特异度(77.00%)却低于文献报道(93.5%～100.0%)[2,11,15]；提示对于涂阴疑似肺结核患者，GeneXpert对MTB的检出率明显高于痰培养。这可能与大多数涂阴肺结核患者在进行结核病诊断前均接受过β内酰胺类药物的治疗，而该药物对MTB有一定的杀灭作用，导致痰标本中MTB荷载量较少或未能及时培养而导致痰培养阴性[16]有关。而GeneXpert是基于定量PCR的分子检测，能够从已经灭活的MTB中扩增出MTB核酸并报告诊断，可出现痰培养阴性而GeneXpert检出阳性的情况[17]。

另外，本研究中GeneXpert检测RR-TB与比例法药敏试验结果呈高度一致性，两种方法检出的利福平耐药率差异无统计学意义，然而GeneXpert检测时间远短于比例法药敏试验，可以及时为临床医生调整治疗方案提供细菌学依据；但也有研究表明，分子药敏试验检测对利福平耐药的稳定性和重复性较比例法药敏试验好，但如果GeneXpert检测应用于初治肺结核患者(非耐药高危人群)时可能会出现假阳性的可能，因此如果在非耐药高危人群中检出结果为对利福平耐药时，仍需结合临床和表型药敏试验或其他分子药敏试验的检测结果做进一步验证[18-19]。本次研究还发现，当患者为非结核分枝杆菌与MTB混合感染时，比例法药敏试验会受到非结核分枝杆菌优势菌的影响，仅能检出对利福平耐药的非结核分枝杆菌；而对于GeneXpert检测，即使在非结核分枝杆菌浓度很高、MTB浓度很低的混合感染下，仍能检出MTB[20]，但本研究仅1例此类患者，可能结论存在偏颇，望今后能进一步研究。

综上所述，GeneXpert是一种操作简便、检出时间短的分子检测技术，在涂阴疑似肺结核患者中相对于固体痰培养具有较高的MTB检出率，并且对于RR-TB检测的敏感度也较高，可推荐作为基层结核病定点医院临床快速确诊涂阴疑似肺结核及RR-TB的检测手段，使结核病患者得到及早诊断和治疗，对涂阴肺结核以及利福平耐药肺结核的控制具有重大意义。但目前GeneXpert检测设备及配套的试剂盒相对于固体痰培养与比例法药敏试验的费用均较昂贵，若在基层结核病定点医疗机构推广使用，则需要政府加大财政投入或医保政策给予支持。