产前诊断检测技术的新进展

杨冬艳　庞丽红

【摘要】 产前诊断是指对胎儿进行先天性缺陷和遗传性疾病的诊断，是防控出生缺陷及提高人口素质的主要手段。产前诊断实验室检测方法多样，从20世纪60年代的染色体核型分析发展到现在的基因测序技术，各种产前诊断实验室检测技术各有优缺点。现就产前诊断实验室检测技术的进展及各产前诊断实验室检测技术的特点展开综述。

【关键词】 产前诊断; 染色体核型分析; 基因测序

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.084 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）13-0-04

近年来随着高龄妊娠人数和环境污染的增加，出生缺陷的发生率在逐年上升。产前诊断可以有效地预防出生缺陷的发生，所以产前诊断越来越受到社会各界的重视。产前诊断技术是为了尽量控制出生缺陷，而通过各种方法检测胎儿出生前患某种遗传性疾病或先天畸形与否。产前诊断实验室检测技术主要包括：（1）染色体核型分析;（2）分子细胞遗传学分析技术：荧光原位杂交（FISH）、微阵列芯片杂交技术等;（3）PCR;（4）多重连接依赖式探针扩增;（5）基因测序技术：一代测序、二代测序、三代测序、正在研究的四代测序技术等。各种产前诊断实验室检测技术各有优缺点，下面笔者逐一展开叙述。

1 染色体核型分析

自20世纪60年代开始染色体核型分析技术已作为临床上进行产前诊断染色体异常的金标准，常染色体核型分析技术在产前诊断中有G、Q、R、C、N等显带技术，可根据不同的需求来选择。G带带型比较稳定，是最常使用的人类染色体核型分析检测显带技术。目前鉴别G显带核型标准仍然是由人类细胞遗传命名国际体系规定的，检测的染色体是通过与其比对来判定改变与否。临床上常见的遗传病及染色体突变通过G显带核型分析技术来检测准确可靠，该技术应用广泛。为降低出生缺陷、提高出生人口素质，目前我国采用对所有孕妇进行早、中孕期的筛查，对筛查高危者再进行染色体核型分析产前诊断来进一步确诊[1-3]。所以G显带核型分析技术对提高出生人口素质有重要的意义。G显带核型分析可检测>5 Mb的染色体片段结构异常，且具有准确性高，经济实惠等优点。但染色体核型分析无法检测微小变异及缺失。

2 分子细胞遗传学分析技术（包括FISH技术和微阵列芯片杂交技术）

FISH技术是遵循碱基互补的原则，用标记后的DNA作探针，然后与载玻片上待测的DNA互补链进行杂交，然后检测杂交位点荧光判读染色体突变。FISH可直接检测没有经过细胞培养的标本是其最大的优点，最短可在1 h后直接给出诊断。FISH可避免污染，可分析间期细胞，因此其培养失败率低及培养时间短，检测时间亦缩短。FISH检测已知染色体异常较染色体核型分析准确。FISH 技术应用于产前诊断不仅可以加快产前诊断的速度，而且准确性高[4-5]，还可以延长胎儿羊水染色体检查在产前诊断中的时间窗。但FISH 因探针数目有限，只能对少数已知染色体异常进行诊断。

微阵列芯片杂交技术是在全基因组范围内检测染色体的微缺失和微重复，且分辨率高的一种检测技术。它由单核苷酸多态微阵列（SNParray）和比较基因组杂交微阵列（aCGH）组成。SNParray是在基因组水平上通过微阵列检出单个核苷酸的变异的，aCGH 是通过微阵列检出与疾病相关的染色体异常。微阵列芯片杂交技术与前述2个检测技术相比具有通量高、分辨率高和自动化检测高的优势，可以一次性同时检测许多与出生缺陷和先天性疾病相关的基因组异常，近年来已经广泛应用于存在胎儿结构异常的侵入性产前诊断[6-7]。有学者证明了微阵列芯片杂交技术在检测胎儿染色体重组方面的效率，它显著提高了结构性缺陷胎儿的检出率[8]。但微阵列芯片杂交技术只能检测染色体数目重复或缺失，不能检测染色体的结构异常，价格较昂贵。它的适应证是胎儿结构异常，且最好先行染色体核型分析检查。

3 PCR技术

PCR技术是针对人类染色体上具有多态性的短串联重复序列而扩增的，检测出常见的染色体数目异常的时间可短至几小时内，其特点是快速、准确、成本低、敏感性高、特异性高等优点，但其即使结果正常也不能排除染色体畸形，且不能检测染色体嵌合体及易位型，这些限制了其在产前诊断中的应用。但基因一代测序却离不开PCR技术的辅助作用。

4 多重连接依赖式探针扩增技术

多重连接依赖式探针扩增（MLPA）技术是基于 PCR 的一种检测技术，可同时检测多达50个DNA序列拷贝数的变化。是对DNA序列进行定性及半定量分析的方法，主要用于大缺失、重复的检测，但无法同时针对整个外显子的DNA序列进行检测。故临床上对明确致病基因的遗传病可用MLPA技术进行产前诊断[9-10]。

5 基因测序技术

基因测序技术是核酸DNA分子一级结构的测定。应用广泛、发展迅速，已经从第一代发展到第四代。第一代测序技术测序准确性高，但通量较低，成本相对较高;第二代测序技术测序通量大大提高，是目前临床上常用的基因测序方法;第三代测尚待完善;第四代测序技术还在实验阶段。

5.1 第一代测序（包括化学裂解法、Sanger测序）

化学裂解法是基于PCR的DNA测序法进行的，其原理是：先处理有标记的DNA片段，然后特异性切割，并且产生降解产物，再经过电泳和放射自显影之后可读出相应片段DNA的核苷酸序列。此方法為最早的基因测序方法，但其操作复杂，且读取片段短，目前很少应用。

Sanger测序的原理是利用DNA聚合酶以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物设立四种相互独立的测序反应体系，给每个反应体系中加入不同ddNTP作为链延伸终止剂。虽然Sanger法的弊端有：离不开PCR扩增，只能分析单个DNA片段，通量小;自动化程度低，检测速度慢;成本相对较高[11]。但Sanger测序准确性高，目前仍是基因分型的金标准。目前Sanger测序广泛应用于全基因组测序及全外显子测序的假阳性验证方面。对已明确致病基因的遗传性单基因疾病也可使用Sanger测序进行产前诊断[12-13]。

5.2 第二代测序

第二代测序也叫高通量测序，其技术平台包括三个，分别是：ABI公司的Solid测序平台、罗氏公司454测序平台、lllumina公司的Solexa测序平台。三个测序平台都有各自的优点，Solid测序平台测序较准确，最大准确度可达99.94%;454测序平台的测序读长较长，可达400 bp;Solexa测序平台性价比较高，运行成本低。第二代测序技术由于其通量大、可定量、成本低、边合成边测序的优点，其研究及应用越来越广泛。二代测序技术已广泛应用于无创产前诊断（NIPT）及有创产前诊断领域[14-16]。在器官移植配型、肿瘤分子诊断和靶向治疗及在药物个体化治疗等方面的应用也成为热点[17]。二代测序技术应用于全外显子组测序、全基因组测序、基因组重测序、从头测序、全转录组测序、小分子RNA测序等方面。其中应用最多的是全外显子测序，下面笔者着重叙述全外显子测序技术。

于2009年在二代测序基础上开发了全外显子测序（WES）。WES是一种有选择性地捕获和排列所有带注释的蛋白质编码基因编码区域的技术。人类外显子组序列仅占人类整个基因组序列的1%，却有85%左右的人类致病突变包含在里面。WES的优点：WES覆盖范围广;测序成本低;处理时间减少。然而WES也有局限性;某些蛋白质编码区域可能不被覆盖;WES没有涵盖潜在的功能性非编码元素;WES检测结构变化的能力有限。尽管如此，WES仍然是许多研究人员选择的工具，到目前为止通过WES已成功发现了数百种遗传病的致病基因[18-21]。全外显子测序在一家族性房间隔缺损家系中检测出TBX20（D176N）致病突变[22]。因WES技术在遗传病中的广泛应用，对有遗传病家族史的孕妇行产前诊断提供很好的条件。麦明秦等[23]运用WES产前诊断ZMPSTE24基因突变。

5.3 第三代的测序

第三代的测序技术也称单分子测序技术。目前有2种，分别是利用合成测序理论测序的Helisope BioScience公司的SMS技术和以SMRT芯片为测序载体进行的边合成边测序技术的Pacific Bioscience的SMRT技术[11]。第三代测序为单分子测序，不需进行PCR扩增。第三代测序方法的优点为：（1）更高通量;（2）更短测序时间;（3）更长读取长度;（4）更高精确性，可以检测出极少的变异;（5）需要很少起始量;（6）更低的成本。当然其也有缺点：（1）很难保持酶的活性与稳定性;（2）很难在提高单分子信号灵敏度同时又不会把信号变成噪音增加荧光背景;（3）很难保持DNA的延展性而又不出现二聚体结构等。因为超长的读取长度[24]，单分子测序技术前景广阔，其可以在产前诊断中的应用被广泛关注。2017年11月6日经济日报刊登了一例第三代单分子基因测序仪成功应用于无创产前检测（NIPT）的报道。第三代单分子基因检测技术有望在不久后应用于产前诊断方面，在基因检测领域发挥更大作用。

5.4 第四代测序

第四代测序技术为纳米孔测序技术，它改变了传统的方法即序列读取需要在复杂的酶促反应中进行，而是通过力学、电学等对DNA分子中的碱基直接判读，但其尚处于研究当中。其中代表性的方法是Nanopores测序法，它是一种基于电信号测序的新型技术。第四代测序技术的优势有：操作简单、成本低、快速[25]。虽然目前第四代测序技术尚处于研究中，还不完善，但有望在不久的将来人们能利用其以最快的速度得到人类基因组信息，并期望其能用于产前诊断领域，为优生优育事业 做贡献。

6 小结与展望

综上所述，产前诊断实验室检测技术发展迅速，科技的发展推动着产前诊断实验室检测技术的发展，产前诊断实验室检测技术已从20世纪60年代的染色体核型分析发展到现在的基因测序，是朝着更快速、准确、方便、经济的方向发展。各种产前诊断实验室检测技术各有优缺点，各有其适用范围。目前染色体核型分析仍然是产前诊断的金标准，当胎儿存在结构异常时可加做微阵列芯片杂交等，近年来基因测序技术发展迅速，其中二代测序近年来发展尤为迅速，其在遗传性单基因疾病的产前诊断中的应用及植入前产前诊断的应用越来越被重视。产前诊断实验室检测技术的发展对防控出生缺陷及提高人口素质有重要意义。

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