环状RNA在肿瘤发生和发展过程中的作用研究进展

郑乔安，陈玉华 ，陈晓铭* （. 广东医科大学附属医院，广东湛江 5400；. 广东省深圳市龙岗区人民医院，广东深圳 58000）

提 要：环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种广泛存在于各种生物体中具有闭合环状结构的非编码RNA 虽曾一度被认为是基因转录过程中的副产物或剪切错误产生的无功能片段，但随着基因组微阵列以及全基因组测序技术的进步，人们已发现circRNA在肿瘤的发生、发展过程中起着举足轻重的作用，且有望成为新型的肿瘤标志物或治疗靶点，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方向。该文就circRNA的生物学特征及在肿瘤发生和发展过程中的最新进展进行了综述。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类内源性非编码RNA，Hsu等[1]在1979年第一次发现RNA以环状的结构形式存在于真核细胞的胞质中，由于circRNA表达水平低，最初被认为是剪接体介导的拼接错误所产生的副产品或逃逸内含子套索的中介产物，因此并未受到广泛的关注。但近年来，随着基因组微阵列以及全基因组测序技术的快速发展，人们发现circRNA密切参与了肿瘤的发生、发展，在肿瘤细胞的增殖与凋亡、侵袭、转移等过程中均有着举足轻重的作用，circRNA有望成为新型的肿瘤标志物及治疗靶点，本文就circRNA的结构、形成、特征及在肿瘤方面的进展进行了综述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA结构

circRNA通过特殊的剪接方式，将RNA的5'帽结构和3'多聚腺苷酸尾结构连接形成闭合的环状结构，因此结构更稳定，不容易被降解[2-4]。

1.2 circRNA种类

根据基因组的来源及构成序列的不同，目前已知的常见circRNA的种类有3种：外显子来源的环状RNA(exonic circ RNAs，ecircRNAs)、内含子来源的环状RNA(intronic circRNA，ciRNAs)、由内含子及外显子共同形成的环状RNA(exon-intron circ RNA，Elci RNAs)，其形成过程及种类见图1[5]，此外还有基因内来源的circRNA及基因间来源的circRNA[5-6]。

1.3 circRNA形成方式

circRNA的形成方式有多种假说[3-4,7-9]，其中以套索驱动的环化机制(图2a)和内含子配对驱动的环化机制(图2b)最为常见，另还有内含子形成的circRNA(图2c)和RNA结合蛋白驱动的环化机制(图2d)。Circ-RNA的形成机制的研究对于人类探究circRNA的功能有着积极的促动作用，但许多机制的研究仍处于起步阶段，仍需进一步解析和验证。

1.4 circRNA的特征

图1 circRNA的形成及种类[5]

图2 circRNA的形成机制[9]

circRNA具有以下特征：(1)广泛存在于动物、植物、病毒等各种生物体内，且在不同的物种中具有高度保守性；(2)大部分circRNA位于细胞质中，在细胞核、血浆、外泌体、唾液中也有一定的表达，具有一定的组织、时间特异性；(3)circRNA大多数来源于外显子，少部分来源于内含子[5-6]；(4)呈闭合环状结构，稳定性强；(5)大多数circRNA是非编码RNA。

2 circRNA与肿瘤

自从20世纪70年代circRNA被发现以后，现已经有大量的报道证实了circRNA与肺癌、胃癌、肝癌等肿瘤密切相关，circRNA在肿瘤中的差异性表达起着原癌基因或抑癌基因的作用，且与肿瘤的侵袭转移、分期分型等临床特征密切相关，其最主要是通过作为微小RNA(miRNA)的“海绵”来发挥作用，现将新近发现的circRNA在常见肿瘤的表达总结如表1所示。

2.1 circRNA与消化道肿瘤

肝癌是一种常见的恶性肿瘤。大多数原发性肝癌病例为肝细胞癌(HCC)，且往往在晚期才能被确诊，虽然外科手术及放化疗技术有所进步，但肝癌预后仍较差[32-33]。有研究将一个在HCC组织中显著上调的circRNA命名为circFBLIM1，并发现下调该circRNA可抑制HCC的生长和侵袭，促进细胞凋亡，通过采用荧光素酶和RNA免疫沉淀法(RIP)得出结论：circFBLIM1可能作为一种内源竞争RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)，通过海绵化miR-346来调控肝癌的FBLIM1表达[10]。

食管鳞状细胞癌(ESCC)是全球排名第六的癌症相关死亡原因，是人类健康面临的挑战之一[34]。肿瘤的转移是导致这种疾病治疗失败的主要原因之一[35]，但关于ESCC转移的机制尚未完全阐明，有研究报道了circRNA参与ESCC的迁移与侵袭，该研究指出circRNA ciRS-7在ESCC细胞和组织中过表达，它可通过调节miR-7/KLF4轴和激活NF-κB p65信号从而引起食管鳞癌细胞的迁移和侵袭[11]。 Cao等[12]也指出circRNA_100876在ESCC组织中表达上调，与肿瘤不良预后相关，该circRNA可能通过促进ESCC细胞迁移、侵袭和上皮-间充质转化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)进展，从而促进肿瘤转移。

表1 circRNA在常见肿瘤的表达

胃癌(GC)是消化系统最常见的肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第二大原因[36]。 Sun等[13]通过基因芯片及定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术对62例GC组织及对应癌旁组织检测，发现胃癌组织中circPVRL3的表达明显低于癌旁组织，通过ROC曲线研究还发现circPVRL3水平的下降与TMN分期呈负相关，在进一步的分析中也证明了circPVRL3表达水平较低的患者生存时间明显短于circPVRL3表达水平较高的患者，这些结果表明circPVRL3可能在胃癌的发生、发展中起着保护作用，并可作为评估患者治疗的独立预后因素，此外该研究还指出circPVRL3可能具有编码蛋白质的潜在能力。Ouyang等[14]则发现circPDSS1(Circ0093398)在GC组织中高表达，circPDSS1通过海绵作用miR-186-5p促进GC细胞周期，抑制细胞凋亡，而miR-186-5p通过靶向NEK2抑制细胞周期，促进细胞凋亡。因此，circPDSS1通过调节miR-186-5p和NEK2发挥肿瘤启动子的作用，circPDSS1/miR-186-5p/ NEK2轴可能是一种潜在的生物标志物和治疗靶点。

结直肠癌(CRC)也是一种常见的消化道恶性肿瘤。circITGA7是由整合素亚基alpha 7基因(ITGA7)的外显子4反向剪接衍生形成的一种新的circRNA，其对应的线性ITGA7是则通过线性剪切形成[37]；Li等[15]通过体内和体外实验证明了circITGA7和ITGA7在CRC组织和细胞系中均显著下调，且两者对CRC细胞均有抑制作用；circITGA7通过竞争性结合miR-370-3p上调NF1转译而抑制Ras信号通路的同时也可通过RAS途径抑制转录因子RREB1，从而促进其宿主基因ITGA7的转录，最终达到抑制CRC细胞增殖和转移的作用。Jin等[16]发现hsa_circ_0136666在CRC组织和细胞系中明显过表达，下调该circRNA可明显抑制CRC细胞的增殖，hsa_circ_0136666高表达与CRC患者总生存率低有关，这可能是通过“海绵化”miR-136和正向调控SH2B1表达，促进了CRC细胞的增殖和侵袭。这揭示了hsa_circ_0136666/miR-136/SH2B1轴在CRC中的关键作用，为CRC的治疗提供了新的分子靶点。

胰腺癌(PDAC)仍然是全球第四大癌症相关死亡原因[38]。有研究通过20例胰腺癌组织的表达谱分析发现在胰腺癌组织有289个circRNA表达异常，并在进一步的实验发现了多个circRNA与miR-15a/miR 506 的互补序列，推测circRNA可以通过与miR-15a/miR506的相互作用调节胰腺癌的进展[39]。Jiang等[17]发现hsa_circ_0001649在胰腺导管腺癌(PDAC)组织中表达下调，这种下调与PDAC患者肿瘤分期和分化程度相关，hsa_circ_0001649可作为PDAC患者术后独立预后因素。有学者发现circ-IARS在胰腺癌组织和血浆外泌体中表达上调，circ-IARS通过外泌体进入人微血管内皮细胞(HUVECs)，促进肿瘤的侵袭和转移[18]。circ-IARS表达与肝转移、血管浸润、肿瘤结节转移分期呈正相关，与术后生存时间呈负相关。

2.2 circRNA与呼吸道肿瘤

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，可分为非小细胞肺癌(non-small cell Lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell Lung cancer,SCLC[40-41]。 Qu等[19]在NSCLC的研究中发现与正常肺组织相比，hsa_circ_0020123在肿瘤组织中表达升高，hsa_circ_0020123的上调被认为与NSCLC患者分化程度差、淋巴结转移、TNM分期高、预后不良预后密切相关，并在进一步研究的中发现miR-144是与该circRNA相关的miRNA，hsa_circ_0020123可以下调miR-144的表达，调控miR-144靶点(包括ZEB1和EZH2)。与该实验类似，Chen等[20]发现hsa_circ_100395在肺癌组织中表达下调，hsa_circ_100395水平与TNM分期及肿瘤转移呈负相关，过表达该circRNA可显著抑制肺癌细胞增殖，抑制细胞周期进展，减少细胞迁移和侵袭，而这可能是通过作为miR-1228靶向TCF21的“海绵”来发挥作用的。Qin等[21]应用qRT-PCRs方法检测59例NSCLC肿瘤组织和邻近非肿瘤组织的配对样本发现circ-UBR5在NSCLC组织中表达明显下调，且与肿瘤分化相关，该实验还通过Huprot TM芯片和RIP等实验方法提出circ-UBR5可能是参与RNA剪接调控过程的一种新型小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)，此外，他们还首次提出可以应用人类蛋白质微阵列(Huprot™Protoarray)寻找特定circRNA结合蛋白的实验方法。

2.3 circRNA与泌尿系肿瘤

Wang等[22]同样利用qRT-PCR技术通过对52对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)组织及对应癌旁组织中进行检测，发现Hsa_circ_0001451在ccRCC细胞中表达下调，在体外实验中Hsa_circ_0001451的敲除显著促进了体外肿瘤的生长，生物信息学结果也表明Hsa_circ_0001451可能参与了肿瘤进展的调控。

有文献报道circMYLK 在前列腺癌(PCa)组织和细胞中的表达水平明显高于正常组织和前列腺细胞[23]。circMYLK可通过下调miR-29a的表达从而促进PCa细胞增殖、侵袭和迁移。

2.3 circRNA与其他肿瘤

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤[42]， Li等[24]发现与正常脑组织相比，circ-U2AF1在不同级别的神经胶质瘤组织中表达均上调，在细胞试验中沉默该circRNA可降低胶质瘤细胞的转移和侵袭能力，而这可能是通过调控hsamiR-7-5p/NOVA2通道来发挥致癌基因的作用的。胶质母细胞瘤(GBM)是胶质瘤中恶性程度最高的肿瘤，GBM患者可能受益于额外的治疗，如针对分子靶点的个性化治疗。Wang等[25]通过39例GBM患者的标本分析了circRNA在GBM发生中的表达谱，并通过细胞和动物的进一步实验验证CircNT5E作为miR-422a的“海绵”参与了胶质母细胞瘤的增殖、侵袭和迁移。

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，大多数OSCC患者都是在晚期诊断，预后较差[43-44]。 Zhao等[26]对3例OSCC患者唾液中的circRNA进行微阵列筛选，并与3例健康对照组进行比较发现hsa_circ_0001874与TNM分期、肿瘤分级相关，hsa_circ_0001971与TNM分期相关，两者可能成为OSCC患者早期诊断、预后评估和治疗的新靶点。

甲状腺癌是内分泌器官最常见的恶性肿瘤，近几十年来，发病率持续上升[45]。 Ren等[27]利用circRNA 芯片和实时定量逆转录聚合酶链反应等方法推测异常达的circRNA参与了甲状腺乳头状癌的发生、发展，其中hsa_circRNA_047771和hsa_circRNA_ 007148可以作为PTC患者的潜在诊断生物标志物和预后预测因子。Wnt信号通路参与了脊椎动物胚胎发育的许多阶段，其异常激活可促进各种人类癌症的进展[46-47]， 而卷曲蛋白8[48](Frizzled class receptor 8，FZD8)是Wnt信号通路的细胞表面受体之一，Chen等[28]发现CircNEK6通过上调FZD8和靶向miR-370-3p激活Wnt信号通路从而促进甲状腺癌的进展。而Li等[29]发现circNUP214在甲状腺癌组织中表达上调，该circRNA可能是通过作为miR-145的“海绵”促进锌指E-box结合同源异构体2(ZEB2)[49]的上调来发挥致癌作用，提出circNUP214/miR-145/ZEB2轴可能是甲状腺癌靶向治疗的新方向。

乳腺癌是女性中最常见、最具侵袭性的癌症之一，虽然在过去的几十年中已经有了很多的治疗策略，但是乳腺癌的发病率在逐渐增加，患者的预后仍然不理想。为了使乳腺癌的治疗效果最大化，开发早期诊断的生物标志物和新的治疗靶点有至关重要的意义[50-51]。 Liu等[30]研究发现circRNA hsa_circ_0008039 在乳腺癌组织中表达上调，通过小鼠肿瘤模型下调该circRNA可显著抑制乳腺癌细胞的增殖，该研究表明hsa_circ_0008039作为miR-432-5p的ceRNA，hsa_circ_0008039的过表达促进了miR-432-5p功能靶点(E2F3)在乳腺癌中的表达，这意味着hsa_circ_ 0008039/miR-432-5p/E2F3轴可能是乳腺癌一个潜在的治疗靶点。Chen等[31]通过3例三阴性乳腺癌(TNBC)组织及癌旁正常组织进行表达谱分析，并选择其中表达上调最为异常的circEPSTI1(hsa_circRNA_000479)进行验证及进一步研究：通过240例TNBC患者的circEPSTI1表达，发现其高表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TMN分期及不良预后呈正相关；该研究也发现下调circEPSTI1可抑制TNBC细胞增殖，诱导细胞凋亡；体内外实验均证实circEPSTI1通过作为miR-4753和miR-6809的“海绵”来调节BCL11A的表达从而影响TNBC的增殖和凋亡。

3 小结

circRNA是一种结构稳定的且广泛表达的一种新型的RNA，大量的研究已证实了circRNA对肿瘤的发生、发展有着显著的调控作用，提示circRNA有望成为一种新的肿瘤标志物及治疗靶点。但有关circRNA的研究仍处于初始阶段，仍有许多的问题有待解决。如circRNA除了通过作为miRNA的“海绵”外还可参与基因的转录调控从而调控肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭，但其具体分子机制是什么?circRNA是否可通过其他途径影响miRNA的表达?另外，circRNA在血浆及外泌体中也有表达，但现今大部分研究仍着重于circRNA在组织中的表达，对于circRNA在血浆、外泌体、体液中的表达也是知之甚少。这些可能是今后有关circRNA如何调控肿瘤表达的研究方向。虽然circRNA距离真正应用于临床仍任重道远，但相信随着研究的深入，circRNA终将为肿瘤的诊治提供新的方向和思路。