锌指蛋白84基因促进宫颈癌细胞增殖的初步研究

石海燕，胡维维，张 鑫，吕 晋，杨秀媚，颜 菲 （广东省佛山市第一人民医院，广东佛山 528000）

锌指蛋白(ZNF)发现于非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFⅢA中[1]，是真核生物基因组中分布最广的蛋白之一，约占人类基因组编码蛋白数量的1%[2]。ZNF在基因表达调控、细胞分化等方面发挥了重要作用，具有广阔的临床诊断和治疗前景[3]。目前，只有少数的ZNF基因在宫颈癌中做过相关研究，如ZNF582、ZNF1、ZNF268和ZNF516等[4-7]。而ZNF84基因在宫颈癌中对肿瘤发展的关系未见有相关报道。ZNF84位于人类12号染色体q24-q33区[8]，编码区有4个外显子，其中两个专用于编码KRAB/FPBA和KRAB/FPB-B模块，剩余的分别编码锌指单元的N末端氨基酸和C末端阵列。目前有关ZNF84的报道较少，Assou等[9]发现ZNF84在胚胎干细胞和卵巢中高表达；Zhang等[10]则认为ZNF84与脓毒病转录因子的表达有关。因肿瘤发展中的基因表达部分再现了胚胎发育中的基因特征，我们推测宫颈癌中可能存在ZNF84的异常表达，因此本研究初步探讨了ZNF84基因在宫颈病变组织中的表达以及ZNF84对肿瘤细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系Hela细胞和C33a细胞为本单位保存。ZNF84抗体购买自Abcam。内参兔抗人GAPDH多克隆抗体为杭州贤至公司产品。siZNF 84的RNA片段由吉玛生物技术有限公司合成。PCR引物委托上海生工合成和测序，ZNF84引物F：5’-CCCTTTGGATGTAGTGATTGTAGA-3’， R： 5’-ACTCGACCTCTCT CTAAATGCTT-3’； GAPDH引物 F： 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’， R：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3’。PVDF膜、羊抗兔或羊抗鼠二抗购买自碧云天生物技术有限公司。反转录试剂盒、PCR试剂购买自大连Takara公司。胎牛血清、细胞培养基(DMEM)和胰蛋白酶-EDTA消化液购自Life technologies公司。双抗(青霉素、链霉素)、Trizol、三氯甲烷、异丙醇、DEPC H2O、蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液、SP二步法免疫组化试剂盒(带DAB显色液)、柠檬酸缓冲液(IHC抗原修复液，100×)和蛋白印迹试剂盒均购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 组织来源 宫颈组织均来自本院病理科2015年1月至2016年5月手术切除和活检的60例标本。其中15例正常宫颈组织，患者年龄为42～56岁，平均年龄(50.0±4.1)岁。45例宫颈癌组织，患者年龄为30～73岁，平均(50.1±5.3)岁；其中高分化癌10例，中分化癌24例，低分化癌11例；FIGO(Feder-ation International of Gynecology and Obstetrics)Ⅰ期21例，Ⅱ～Ⅳ期24例；鳞癌22例，其中高分化2例，中分化17例，低分化3例；FIGOⅠ期12例，Ⅱ～Ⅳ期10例；腺癌23例，其中高分化8例、中分化7例、低分化8例，FIGOⅠ期9例，Ⅱ～Ⅳ期14例。所有纳入对象均未接受过放疗和化疗。

1.2.2 免疫组化 组织标本采用免疫组化SP法检测。ZNF84一抗稀释浓度为1∶100，以PBS代替一抗作为空白对照。选取癌细胞较多的5个高倍视野(×400)，每个视野计100个细胞。染色强度分级：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。阳性细胞百分比分级：阳性细胞<30% 1分，阳性细胞数在30%～60% 2分，阳性细胞数>60% 3分。结果判断：两项得分相加 0分为阴性(－)， 1～3分为弱阳性(+)，4～5分为中阳性(++)，6分为强阳性(+++)[11]。

1.2.3 细胞培养 人宫颈癌细胞系Hela细胞和C33a细胞分别用含有10%(体积分数)胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，置37 ℃、含5%(体积分数)CO2的恒温细胞培养箱中培养。

1.2.4 细胞转染 转染前1d取对数生长期的细胞，经0.25%胰酶消化后显微镜下进行细胞计数，按每孔3×105个细胞的密度铺于6孔板中，按不同的实验目的进行分组，检测siZNF84对细胞的影响。每种细胞株设对照组和siZNF84组。细胞完全培养基培养，待细胞汇合度达60%～80%时，按照1 μg质粒：2 μL Lipo2000的比例进行空载体质粒和siZNF84质粒的转染，4 h后换液继续培养。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖 将转染后各实验组6孔板细胞以每孔5×103细胞密度铺板于96孔板中，每组细胞设5个复孔，并设3孔培养基作空白组，于l、2、3 d时分别加入CCK8，每孔10 μL，1～2 h后采用酶标仪检测450 nm处吸光度值。细胞增殖抑制率计算公式为：(对照组实际吸光度值/干扰组实际吸光度值－l)×100%。

1.2.6 Real-time PCR 采用TRIzol(Invitrogen)法提取总RNA。cDNA的合成是用随机六聚体引物iScriptcDNA合成试剂盒(BioRad)和500 ng总RNA按说明书制作而成。反应生成的cDNA置于－80 ℃保存。取1 μL cDNA作为模板，加入5 μL SYBR Green Mix、0.2 μL 10 mmol/L上游引物、0.2 μL 10 mmol /L下游引物，5.6 μL ddH2O，混匀后进行定量PCR反应。反应条件为95 ℃预变性10 min， 95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。每种样本的siZNF84和GAPDH设3个复孔，反应结束后样品置于4 ℃保存。定量PCR检测人宫颈癌细胞系Hela细胞、C33a细胞对照组以及实验组RNA的表达差异。

1.3 统计学处理

运用SPSS19.0软件分析实验结果，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，计数资料采用(校正)χ2检验或确切概率法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZNF84在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达

ZNF84在宫颈癌组织有表达，而在正常宫颈组织中无表达，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表1。镜下观察发现ZNF84蛋白在肿瘤细胞中主要表达于细胞核及核周位置，见图1。

表1 宫颈癌组织和正常宫颈组织中ZNF84的表达情况例(%)

图1 ZNF84在正常宫颈(左图)和宫颈癌组织(右图)中的表达(×10)

2.2 ZNF84的表达与患者临床病理特征的关系

ZNF84表达与肿瘤大小、HPV感染有关(P<0.01或0.05)，而与其他临床病理特征无关(P>0.05)，详见表2。鳞癌中ZNF84的表达与患者的临床病理特征均无关系(P>0.05)，详见表3。腺癌组织中ZNF84的表达与肿瘤大小、HPV感染有关(P<0.05)，而与其他临床病理特征无关(P>0.05)，详见表4。

2.3 ZNF84 RNA干扰序列转染宫颈癌细胞对ZNF84表达的作用

表2 ZNF84的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

接上表

表3 ZNF84表达与鳞癌患者临床病理特征的关系

与对照组相比，Hela和C33a组的siZNF84 mRNA分别下降51.1%和57.6%，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图2。

2.4 干扰ZNF84的表达对宫颈癌细胞的影响

Hela细胞在24、48、72 h分别抑制了32.74%、31.17%和23.54 %，C33a细胞在24、48、72 h分别抑制了22.13%、32.26%和24.32%。siZNF84组细胞数均明显少于对照组(P<0.05)，见图3。

图2 siZNF84转染Hela细胞和C33a细胞后检测其RNA及蛋白表达

表4 ZNF84表达与腺癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，位居世界第3位，严重危害女性的生命健康。研究提示宫颈癌与HPV感染密切相关[11-13]。本研究免疫组化结果表明ZNF84在宫颈癌组织有表达，而在正常宫颈组织中则无表达。45例宫颈癌石蜡切片中有35例ZNF84表达阳性，表达率为77.8%。ZNF84在人类胚胎干细胞和卵母细胞中呈高水平表达[8]，在体内多种器官和组织中均有不同程度的表达，在子宫和宫颈组织中无表达，与本实验正常宫颈组织中无ZNF84表达的结果一致。ZNF84的表达与宫颈癌患者的肿瘤大小有关(P<0.01)，在3例肿瘤直径<2 cm的肿瘤组织中未见ZNF84蛋白表达，而在直径≥2 cm的肿瘤组织中ZNF84的表达率为83.3%，提示宫颈癌组织中出现了ZNF84蛋白亚群。ZNF84表达与宫颈癌组织的HPV感染有关(P<0.05)，HPV感染患者的ZNF84阳性的表达率比非HPV感染患者高。在23例宫颈腺癌组织中ZNF84表达亦与肿瘤大小、HPV感染有关(P<0.05)，而与其他临床病理特征无关系(P>0.05)，提示ZNF84参与了宫颈癌的发生和发展，或对宫颈癌细胞的增殖能力有一定的影响。

为了探讨ZNF84基因对宫颈癌细胞增殖的影响，及其与腺癌和HPV的关系，我们选用了Hela和C33a两种宫颈癌细胞株进一步研究。Hela细胞为腺癌细胞且HPV18阳性，C33a细胞为HPV阴性。实验通过干扰该基因mRNA的表达检测细胞增殖能力的变化。结果表明，siZNF84转染后，宫颈癌细胞Hela和C33a的ZNF84 mRNA明显降低，基因表达的差异有统计学意义(P<0.05)，表明本实验通过RNA干扰技术在宫颈癌细胞中成功干扰了ZNF84的表达。CCK8细胞增殖结果亦表明，两种细胞株经ZNF84干扰后与对照组比较，其细胞增殖能力均显著下降(P<0.05)，提示ZNF84在体外可以促进Hela和C33a的细胞增殖。

图3 siZNF84转染抑制宫颈癌细胞的增殖能力