牛磺酸颗粒色素含量分析

覃婷婷，荣 姣，黄哲甦

(1.天津市药品检验研究院，天津 300070； 2.天津大学药物科学与技术学院，天津 300070)

牛磺酸颗粒为解热镇痛类药物，其主要成分牛磺酸是一种具有多种生理和药理活性的人体必需氨基酸，具有解热、镇静、镇痛、抗炎等作用，还可提高肌体非特异性免疫功能。主要用于缓解感冒初期的发热和上呼吸道感染[1]，临床上还用于治疗心血管疾病、糖尿病、肝炎等疾病[2，3]。本研究在2017年度国家药品评价性抽验中收集到的牛磺酸颗粒大部分为黄色颗粒，处方所用着色剂大部分都为柠檬黄，而柠檬黄是一种人工合成的偶氮型酸性染料，具有一定毒性，大量使用能对人体产生一定的危害[4]。同时，牛磺酸颗粒的使用人群很大一部分是儿童，但是目前我国尚未对药品中的色素添加量进行规定，存在一定的安全隐患，因此本文参考相关文献[5，8]建立了牛磺酸颗粒中色素的检测方法，并对市场上不同企业产品的色素含量进行了考查。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260 液相色谱仪(带DAD检测器)，Mettler XS 205十万分之一天平，水浴锅，抽滤泵。

1.2试药 食用合成色素柠檬黄溶液标准物质[中国计量研究院，GBW(E)100001a，0.5 mg/ml]，食用合成色素日落黄溶液标准物质[中国计量研究院，GBW(E)100003a，0.5 mg/ml]，牛磺酸颗粒70批样品均为国家药品抽验样品。甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，醋酸铵(色谱纯，Fisher Chemical)，柠檬酸、甲酸、乙醇、氨水、聚酰胺粉为分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Agilent zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇为流动相A，0.02 mol/L醋酸铵溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱，柠檬黄检测波长为426 nm，日落黄检测波长为486 nm，柱温40 ℃，流速1.0 ml/min。

表1 色素测定梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 分别精密量取食用合成色素柠檬黄溶液标准物质和食用合成色素日落黄溶液标准物质各0.02、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 ml，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述溶液用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为线性试验对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取样品2 g，精密称定，加水10 ml，滴加20%柠檬酸溶液调节pH值至6，于60 ℃水浴中放置5 min，将1 g聚酰胺粉加10 ml水(20%柠檬酸溶液调节pH值为4)调成粥状，倒入上述溶液中，搅拌片刻后以G3垂熔漏斗抽滤，用60 ℃水(20%柠檬酸溶液调节pH值为4)洗涤3次，每次10 ml，然后用10、5和5 ml甲醇-无水甲酸(6∶4)的混合溶液分别洗涤3次，再用水洗涤至滤液呈中性，用乙醇-氨水-水(7∶2∶1)混合溶液解吸洗涤3次，每次5 ml洗至无色，收集解吸液于水浴上蒸干，放冷，加水溶解并定容至10 ml，经0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.3空白溶液的制备 按牛磺酸颗粒处方，称取除色素外的原辅料，混匀后，称取2 g，照“2.2.2”项下方法制备空白溶液。

2.3系统适用性试验 分别精密量取食用合成色素柠檬黄溶液标准物质和食用合成色素日落黄溶液标准物质1 ml，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。取系统适用性溶液用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样20 μl分析，理论板数以柠檬黄计为5 154，日落黄与柠檬黄分离度为30。见图1。

1.柠檬黄 2.日落黄图1 对照品(A)供试品(B)空白(C)HPLC色谱图

2.4线性试验 取“2.2.1”项下系列对照品溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样，以浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。结果柠檬黄在0.1～25 μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，线性方程Y=32.095X-2.776 5(r=0.999 9)；日落黄在0.1～25 μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，线性方程Y=21.257X-1.665 2(r=0.999 9)。

2.5精密度试验 取10 μg/ml的柠檬黄和日落黄对照品溶液，连续进样5次，柠檬黄峰面积RSD为0.16%，日落黄峰面积RSD为0.36%。说明方法精密度良好。

2.6重复性试验 取某一企业的牛磺酸颗粒样品，精密称取2 g，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法重复制备6份，进样分析，平均含柠檬黄11.4 μg/g，RSD为0.96%。说明重复性良好。

2.7加样回收率试验 取已知含量的同一批样品，精密称取1 g，置小烧杯中，制备9份待用。精密量取食用合成色素柠檬黄溶液标准物质和食用合成色素日落黄溶液标准物质各1 ml，置同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.8、1.0和1.2 ml至上述加样品的小烧杯中，每个浓度重复3份，自“加入20%柠檬酸溶液调节pH值为6”开始照“2.2.2”项下方法制备加样回收率试验溶液。取上述溶液进样分析。柠檬黄平均回收率为96.42%，RSD为1.96%(n=9)；日落黄平均回收率为95.29%，RSD为1.88%(n=9)。结果见表2 和表3。

表2 柠檬黄加样回收率试验结果(n=9)

表3 日落黄加样回收率试验结果(n=9)

2.8定量限与检出限 取柠檬黄和日落黄标准溶液稀释一系列浓度溶液进样分析，柠檬黄和日落黄均为0.1 μg/ml浓度时，信噪比约为10，定量限为1 ng；二者浓度为0.03 μg/ml浓度时，信噪比约为3，定量限为0.3 ng。

2.9样品测定 取收集到的17家企业的70批牛磺酸颗粒进行了色素测定，测定结果见表4。

3 讨论

3.1色谱条件的选择与优化 前期通过试验发现，如果以甲醇-0.02 mol/L 醋酸铵溶液(10∶90)为流动相等度洗脱，日落黄出峰时间较晚，在10 min以后；若采用梯度洗脱程序在5 min时增加流动相A甲醇的比例至40%以上，尽管可以使日落黄出峰时间提前至7 min，但日落黄峰前面出现负峰，影响积分的准确性，因此最终选择了将甲醇的比例调至30%，既可使日落黄出峰时间提前，又保证了测量的准确性。此外，目前一般文献[6-8]中测定合成色素为了兼顾测定多种色素，波长多选用254 nm，由于收集到的牛磺酸颗粒样品日落黄含量很低，通过DAD检测器扫描发现柠檬黄与日落黄的最大吸收波长分别在428 nm和486 nm，因此选用双波长检测，保证了检测的灵敏度。

表4 牛磺酸颗粒色素测定结果 μg/g

*其中4批检出日落黄，均值为1.3 μg/g，其余5批未检出日落黄。

3.270批牛磺酸颗粒色素含量结果分析 17家企业除企业6和13未检出色素外，其余15家企业产品均检出柠檬黄，其中企业4的全部样品和企业5的部分样品还检出了处方中未标识的日落黄，均约为1 μg/g。不同企业间产品的柠檬黄色素含量差异较大，介于9.5～88.3 μg/g之间(见图2)，其中企业5的批间差异最大，9批样品结果从24.9～61.9 μg/g不等。不同企业产品色素含量差别悬殊，反映出生产企业对于药品中色素的使用安全还不够重视。鉴于目前药品辅料中合成色素的标准体系尚未完善[9]，建议有关部门能出台相应的指导文件，规范药企的生产行为，保障药品的安全性。

不同企业图2 不同企业牛磺酸颗粒柠檬黄含量散点图

3.3市场上柠檬黄色素质量参差不齐 由于企业4和5检出了处方中未列出的微量日落黄色素，因此本文对日落黄色素的来源进行了探讨。17家企业有8家提供了柠檬黄色素，本文对柠檬黄色素的含量进行了检测，其中7家企业柠檬黄含量均大于80%，且未检出日落黄，而企业4 的柠檬黄色素柠檬黄含量仅为56.6%，并含有1.9%的日落黄，由此可见，企业4产品中检出的日落黄应该是来源于柠檬黄色素。而企业5的9批样品中有4批检出了日落黄，另外5批未检出，通过辅料使用信息对比发现，企业5的9批样品分别使用了两个辅料企业生产的柠檬黄色素，检出日落黄色素的4批样品均使用了企业A的相同批次柠檬黄色素，而未检出日落黄色素的样品则使用的是企业B的柠檬黄色素， 推测是由于使用了不同来源的柠檬黄色素导致企业5牛磺酸颗粒色素种类和含量出现较大差异。可见目前市面上柠檬黄色素的质量参差不齐，个别色素生产企业的柠檬黄色素含量较低，且副染料含量较高，导致药品制剂生产企业产品的色素含量批间均一性较差，建议药品生产企业应关注色素辅料的质量并对制剂中色素的含量进行控制，从而保证产品质量的稳定、均一，同时有关部门应加强对药用辅料生产过程的管理工作。