miR-155在急性胰腺炎患者血浆中的表达及临床意义

郭广洋 王 宏

本溪市中心医院(辽宁 本溪 117000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常见的急腹症内科疾病之一，是由多种病因导致胰腺内胰酶被激活从而引发胰腺组织自身的炎症反应[1]。急性胰腺炎主要包括轻症急性胰腺炎(MAP)、中度重症急性胰腺炎(MSAP)和重症急性胰腺炎(SAP)[2]。AP 的临床诊断主要结合急性胰腺炎临床症状、血生化指标以及影像学检查等，但这些诊断方法缺乏特异性，可能出现误、漏诊[3]。临床上评估急性胰腺炎患者病情及预后常用的方法包括Ranson 评分、CT严重度指数(CTSI)评分等，各评分系统也均存在各自的优缺点。MicroRNA是一种非编码RNA，可以调控靶基因表达，在免疫应答和炎症反应过程中发挥重要的作用[4]。研究表明[5]，miR-155作为炎性调控因子在AP病理过程中发挥重要的作用，通过抑制 miR-155 在小鼠中的表达，能显著改善小鼠胰腺的病理学损伤。本研究检测急性胰腺炎患者血miR-155表达水平，为探讨其作为早期预测及预后的血清学标志物提供实验基础。

1 方法

1.1对象和分组 选取我院2016年3月～2018年3月收治的40例急性胰腺炎患者为病例组，分为轻症急性胰腺炎患者(MAP 组，n=20)和重症急性胰腺炎患者(SAP 组，n=20)，并随机选取同期20例健康体检者为对照组(Con组，n=20)。

1.2材料和试剂 血清/血浆microRNA快速提取试剂盒购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司、反转录及实时荧光定量PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司。

1.3血浆样品的制备 空腹采集各组患者外周静脉血5 mL，肝素钠抗凝，4 ℃静置1 h，2000 r/min，离心10 min，收集上清液置于RNase-free离心管中，保存于液氮中备用。

1.4血浆microRNA的提取及Real-Time PCR 应用microRNA快速提取试剂盒，按照试剂盒说明书步骤提取血浆中的microRNA，紫外分光光度计测量RNA浓度，取300 ng RNA样品进行反转录，反转录后取2ul cDNA进行qPCR检测，反应条件为：95°C预变性10sec，95°C5sec，60°C20sec，扩增40个循环。miR-155的相对表达量以试剂盒内的U6引物为内参，采用 2-△△ct法进行分析。miR-155引物序列为F:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTT-GAGACCCCTAT-3’，R:5’-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT-3’。

1.5急性胰腺炎病情严重程度评估 ①Ranson评分[6]：由入院时检测的5 项指标以及入院48 h 时检测的6 项指标组成，每项指标记为1分，总分<3 分为轻症急性胰腺炎，总分≥3 分为重症急性胰腺炎。②CT 严重程度指数(MCTSI)评分[7]，总分为10分，急性胰腺炎形态学改变依照MCTSI分为MAP(0～3分)、MSAP(4～6)和SAP(7～10分)

1.6统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准表示，多组间独立样本比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P< 0.05有统计学意义。

2 结果

2.1三组患者血浆中miR-155表达水平的检测 提取患者外周血浆microRNA，反转录后通过Real-Time PCR检测miR-155的表达水平，采用 2-△△ct法进行分析，结果显示：与对照组相比，MAP 组和SAP 组患者血浆miR-155表达水平升高(P<0.05)，且SAP 组miR-155表达水平高于MAP 组(P<0.05)(图1)。

图1 血浆miR-155Real-Time PCR检测结果注:* 与Con组比较，P<0.05；#与MAP组比较，P<0.05

2.2血浆miR-155 表达与急性胰腺炎患者临床特征的关系 AP患者外周血血浆中miR-155表达量与年龄、性别无关(P>0.05)，差异无统计学意义。不同Ranson 评分及MCTSI 评分的急性胰腺炎患者血浆中miR-155表达量不同，Ranson 评分≥3 分、改良的CT 严重指数(MCTSI)评分≥4 分，急性胰腺炎患者血浆miR-155表达水平高于Ranson 评分<3 分、MCTSI 评分<4 分，差异有统计学意义(P<0.001)见表1。

表1 急性胰腺炎患者临床特征与血浆miR-155表达的关系

3 讨论

急性胰腺炎是临床上常见的炎症性疾病之一，它不仅累及胰腺及周围组织，治疗不及时还可以诱发全身炎性反应综合征、脓毒症、休克以及多器官功能障碍综合征等，病死率较高[8-9]。急性胰腺炎的主要临床表现包括急性发作的持续性上腹部剧痛，常伴有背部放射性疼痛、恶心及呕吐等。轻症患者症状不明显，主要表现为腹部轻压痛，重症患者表现为上腹部持续性刀割样剧烈疼痛，可蔓延至全腹，出现腹膜刺激征[10]。急性胰腺炎的临床表现呈现多样性，能够反映病情严重程度的临床表现的特异性差，对于不良预后的预测敏感性低[11]。临床上，实验室各类血生化检测指标常用于判断急性胰腺炎病情的严重程度，如血浆 C 反应蛋白(CRP)、尿素氮、酯酶和淀粉酶等；但这些诊断方法也缺乏特异性，其他疾病如急性阑尾炎，肠梗阻等疾病也能引起类似酯酶和淀粉酶的增高的表现[12]。各类评分系统如 Ranson 评分、急性生理和慢性健康状况评分(APACHEⅡ)评分、CTSI评分、急性胰腺炎床边严重指数评分(BISAP)评分、胰腺炎结局预测(POP)评分系统等，也常用于判断急性胰腺炎病情的严重程度及愈后，这些评分系统种类较多，各有优势和缺点。一些评分系统如Ranson 评分、APACHE Ⅱ评分虽得到认可，但因其所涵盖的因素较多，临床应用较为困难，其他简易评分如POP等，还缺乏足够的验证及研究，所以寻找特异性的生物标记物，对急性胰腺炎的早期诊断、病情评估、临床治疗及预后评价都具有重要的意义。

microRNA作为一种非编码 RNA，与靶基因的 3′非编码区结合，抑制靶基因mRNA 的翻译，调控靶基因表达，在许多病理、生理过程中发挥重要的作用[13]。研究发现，一些microRNA可以作为急性胰腺炎诊断和预后潜在的生物标志物[14-16]。应用SAP小鼠动物实验研究发现，在动物模型的胰腺和肠上皮细胞中，miR-155的表达显著增高，通过抑制 miR-155的表达，能显著改善小鼠胰腺的病理学损伤[5-17]，说明miR-155的表达与急性胰腺炎的发生密切相关。

本研究检测急性胰腺炎患者血浆中miR-155的表达水平，结果显示：与对照组相比，MAP 组和SAP 组患者血浆miR-155表达水平升高(P<0.05)，且SAP 组miR-155表达水平高于MAP 组(P<0.05)，随着病情的严重程度增加，miR-155的表达增加，这表明miR-155有可能成为胰腺炎诊断的生物标志物。本实验分析了miR-155表达与部分临床特征的关系，发现AP患者外周血血浆中miR-155表达量与患者的年龄、性别无关，差异无统计学意义(P>0.05)。不同Ranson 评分及MCTSI 评分的急性胰腺炎患者血浆中miR-155表达量不同，Ranson 评分≥3 分、改良的CT 严重指数(MCTSI)评分≥4 分，急性胰腺炎患者血浆中的miR-155 表达水平高于Ranson 评分<3 分、MCTSI 评分<4 分的急性胰腺炎患者，差异有统计学意义(P<0.001)。

本研究通过检测血浆miR-155作为诊断急性胰腺炎及鉴别其严重程度的生物学标记物，发现其在急性胰腺炎患者中高表达且表达程度与疾病严重程度呈现正相关，为进一步探讨其作为早期诊断及预后的血清学标志物提供了实验基础。