外周血循环肿瘤细胞与膀胱癌患者临床特征、复发转移的关系

金一，李江松，李博

聊城市中医院泌尿外科，山东 聊城2520000

膀胱癌是发病率和病死率最高的泌尿系统恶性肿瘤，恶性程度较高，常呈现浸润性发展，术后1年复发转移的风险超过45%[1]。远处转移是膀胱癌患者死亡的主要原因，寻找一个有价值的血清标志物来检测膀胱癌的复发和转移情况具有重要意义。血行转移是多数恶性肿瘤发生远处转移的主要途径，外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）在恶性肿瘤血行转移的主要表现为肿瘤细胞从原发病灶脱落，突破一系列屏障进入外周血，形成CTC，然后在一定条件下定植于远处器官，形成恶性肿瘤的转移病灶。早期检测血液中的CTC，并实施干预，对恶性肿瘤的治疗、预后评估和随访监测具有重要意义[2]。多项研究证实，CTC与前列腺癌[3]、非小细胞肺癌[4]、乳腺癌[5]等多种恶性肿瘤的复发转移有关，可作为预测恶性肿瘤患者无瘤生存情况的重要指标。目前，关于CTC与膀胱癌的临床特征和预后关系的研究较少。本研究探讨膀胱癌患者术前外周血CTC与临床特征的关系，并分析其对术后复发转移的预测效果，旨在为临床提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月至2016年6月聊城市中医院收治的膀胱癌患者。纳入标准：①术前均接受血清CTC检测；②均接受膀胱癌根治术治疗。排除标准：①术前已发现存在远处转移；②合并其他恶性肿瘤；③既往接受放疗、化疗等任何抗肿瘤治疗。根据纳入和排除标准，本研究共纳入68例膀胱癌患者，其中男47例，女21例，年龄为51～82岁，平均年龄为（63.2±7.1）岁。

1.2 CanPatrolTM法检测外周血CTC水平

所有患者术前1天清晨空腹采集了肘静脉血5 ml，保存至乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，混匀，室温静置30 min后，2000 r/min，离心20 min，去除上清液。将离心后的沉淀转移至过滤器中过滤，甲醛室温固定60 min。加入透化剂室温孵育5 min，加入消化酶室温孵育60 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤3次。将样品置于40℃生化培养箱中，依次加入探针工作液孵育180 min，预扩增工作液孵育30 min，扩增工作液孵育30 min，显色工作液孵育30 min，每次加入工作液孵育完成后PBS洗涤3次，最后加入含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗淬灭剂，室温静置5 min后直接在显微镜下观察。依据细胞内荧光信号的颜色判断CTC的分型，细胞内荧光信号颜色为绿色判定为间质型，红色判定为上皮型，若同时存在绿色和红色荧光信号，则判定为混合型。

1.3 资料收集和随访方法

收集所有患者的基本临床特征，包括性别、年龄、吸烟史、肿块数目、肿瘤直径、肿瘤位置、病理分级、TNM分期和合并肾积水情况等。所有患者术前采用CanPatrolTM法检测了外周血CTC，接受膀胱癌根治术治疗，根据肿瘤浸润情况和手术切除结果等具体情况决定术后是否进行化疗及化疗。采用门诊复查的方式对患者进行了随访，术后第1年每3～6个月进行1次膀胱镜复查，然后每6～12个月复查1次，期间若出现血尿等症状则及时复查膀胱镜，以肿瘤复发转移、死亡或失访为随访终点，随访截至2017年6月30日。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；非正态分布计量资料以中位数表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验；膀胱癌患者术后1年复发转移的影响因素采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存情况的比较

68例膀胱癌患者中检出单纯间质型17例，单纯上皮型21例，混合型23例，7例患者未检出CTC。依据血清CTC检测结果，将其分为单纯间质型组（n=17）、单纯上皮型组（n=21）、混合型组（n=23）和未检出组（n=7）。单纯间质型组、单纯上皮型组、混合型组和未检出组膀胱癌患者术后中位无进展生存期（progress free survive，PFS）分别为12.6、15.7、14.6和17.8个月，组间比较差异有统计学意义（H=23.791，P＜0.01）。本研究主要探讨外周血CTC与膀胱癌患者临床特征，以及术后1年复发转移的关系，故在后续研究中剔除未检出CTC的7例患者。

2.2 基本临床特征的比较

单纯间质型组、单纯上皮型组和混合型组膀胱癌患者性别、年龄、吸烟史、肿块数目、肿瘤直径、肿瘤位置、合并肾积水情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；但3组膀胱癌患者病理分级、TNM分期和淋巴结转移情况比较，差异均有统计学意义（χ2=12.163、11.935、5.717，P＜0.05）。（表1）

2.3 膀胱癌患者术后1年复发转移影响因素的单因素分析

单因素分析结果显示，不同性别、年龄、吸烟史、肿块数目、肿瘤直径、肿瘤位置、合并肾积水情况膀胱癌患者术后1年复发转移情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同病理分级、TNM分期、淋巴结转移情况、CTC分型、术后辅助化疗情况膀胱癌患者术后1年复发转移情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

2.4 膀胱癌患者术后1年复发转移影响因素的多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的因素（包括病理分级、TNM分期、淋巴结转移情况、CTC分型和术后辅助化疗情况）作为自变量，膀胱癌患者术后1年出现复发转移作为因变量，纳入Logistic回归分析，结果显示，单纯间质型CTC、TNM分期为Ⅲ期、有淋巴结转移、未接受术后辅助化疗和病理分级为Ⅲ级是膀胱癌患者术后1年发生复发转移的独立危险因素。（表3）

表1 3组不同CTC分型膀胱癌患者的基本临床特征[ n（%）]

表2 61例膀胱癌患者术后 1年复发转移影响因素的单因素分析

表2 （续）

表3 61例膀胱癌患者术后 1年复发转移影响因素的Logistic回归分析

3 讨论

CTC由恶性肿瘤的原发部位或转移部位释放并进入外周循环，一般情况下，CTC可被吞噬清除或凋亡，但也有少数CTC能存活，且由于其与原发肿瘤具有类似的抗原和遗传性，可能定植于机体的某个部位，形成新的转移灶。目前CTC被认为是恶性肿瘤血行转移的重要基础，一直受到临床的重视，但外周血中CTC的数量较少，仅占外周血白细胞的1/千万～1/百万[6]，检测有一定困难，对操作要求较高。白云金等[7]研究表明，78例膀胱癌患者的CTC阳性率为34.6%，而非肿瘤患者均未检出CTC，且多因素Logistic回归分析显示，肿瘤直径≥3 cm、有肌层浸润、病理分级较低的膀胱癌患者CTC阳性率更高。Rink等[8]研究表明，局限性膀胱癌患者外周血CTC阳性率为30%，其总生存率、无进展生存率、肿瘤特异性生存率均明显低于CTC阴性膀胱癌患者，预后差。本研究采用CanPatrolTM法检测CTC的分型情况，采用标记有DAPI的探针与扩增探针进行杂交来产生荧光信号，以信号的颜色来判断CTC是否存在及其分型，是目前较为先进的CTC检测技术，其优点是不依赖肿瘤特异性抗体，白细胞去除率和肿瘤细胞回收率均较高，已逐渐应用于临床[9-12]。

由于恶性肿瘤细胞的侵袭性与上皮-间充质转化密切相关，即上皮细胞可转化为间充质细胞，因此，CTC主要分为上皮型、间质型和混合型。张瑞赟等[12]研究表明，肌层浸润型膀胱癌患者间质型CTC与混合型CTC的阳性率均明显高于非肌层浸润型膀胱癌患者，但上皮型CTC的阳性率比较，差异无统计学意义，表明间质型CTC可能与肿瘤肌层浸润相关。本研究结果表明，检出CTC单纯间质型17例，单纯上皮型21例，混合型23例，7例患者未检出CTC；进一步分析表明，单纯间质型组、单纯上皮型组和混合型组膀胱癌患者病理分级、TNM分期和淋巴结转移情况比较，差异均有统计学意义；单纯间质型组膀胱癌患者的中位PFS最短，仅为12.6个月；多因素Logistic回归分析结果显示，单纯间质型CTC是膀胱癌患者术后1年出现复发转移的独立危险因素，与Rink等[13]研究结果类似。这可能是因为间质型CTC是肿瘤细胞通过修饰自身形态、骨架结构与黏附分子后转化而成，与上皮型CTC比较，其黏附能力更低，可塑性更强，容易脱落[14]，发生定植转移的风险相对更高，预后更差，间质型CTC对评估膀胱癌患者的预后价值可能更高。

综上所述，不同外周血CTC分型可能与膀胱癌患者的病理分级、TNM分期、淋巴结转移情况有关，单纯间质型的CTC、TNM分期为Ⅲ期、有淋巴结转移、术后未接受辅助化疗和病理分级为Ⅲ级为膀胱癌患者术后1年发生复发转移的独立危险因素。