CALR基因突变与骨髓增殖性肿瘤发病的关系△

秦玉婷，尼罗帕尔·吐尔逊，郝建萍

新疆医科大学第一附属医院血液病中心，乌鲁木齐8300540

骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是一类造血干细胞克隆性疾病，主要病理特征为分化相对成熟的一系或多系髓细胞过剩，骨髓内有核细胞明显增多并向终末分化成熟；其临床表现主要为出血和血栓症状，常伴外周器官浸润和肝脾肿大[1]。经典的MPN包括真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性骨髓纤维化症（primary myelofibrosis，PMF）、原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）3种[2]。近年来国外研究报道，JAK2V617F突变在PV患者中约占95%，在ET或PMF患者中占50%～60%[3]。JAK激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和血小板生成素受体（thrombopoietin receptor，MPL）基因突变的发现为疾病的临床诊断带来了极大的便利[4]，然而对于部分JAK2野生型的PMF或ET患者，目前仍缺乏特异性的诊断标志物，因此寻找特异性的分子标志物对疾病的诊断和治疗具有重要意义。钙网蛋白（calreticulin，CALR）基因突变是目前MPN领域研究的重点，但国内关于CALR基因突变与MPN发病相关性的研究甚少，且尚未有研究明确指出CALR基因突变在MPN发病中的作用机制。本研究通过对237例MPN患者的临床资料进行分析，探讨CALR基因与MPN发病的关系，并分析其可能的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年5月至2017年5月新疆医科大学第一附属医院血液病中心收治的MPN患者的临床资料。纳入标准：①全部患者均符合MPN的诊断标准[5]；②年龄18～80岁；③均有完整的基因、骨髓活检结果。排除标准：①合并其他血液肿瘤患者；②合并继发性骨髓纤维化症、继发性血小板增多症、继发性红细胞增多症者；③临床资料缺失者。根据纳入排除标准共纳入237例MPN患者，其中男121例，女116例；年龄18～79岁，平均（56.0±3.2）岁；PV患者84例，PMF患者20例，ET患者133例。

1.2 资料收集

对全部入组患者的年龄、初诊时外周血象水平、发现病因、症状体征等临床特征进行统计，并进行相关记录和分析。

1.3 CALR基因（9号外显子）突变检测

1.3.1 仪器与试剂5200型台式低速离心机购自日本久保田公司；恒温水浴锅购自苏州珀西瓦尔实验设备有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪购自美国ABI公司；凝胶自动成像仪购自英国Cleaver公司；基因测序仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；全血基因组DNA提取试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司；PCR扩增引物由上海Ivotrogen公司合成。

1.3.2 标本采集 全部患者均于入院后清晨抽取骨髓标本3 ml，置于已加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的真空管中，保存备用。

1.3.3 标本处理 ①取患者的骨髓液约300 μl放于EP管中，加入900 μl细胞裂解液，充分混匀后，室温下静置10 min，摇晃混匀，置于高速离心机，13 000 r/min高速离心20 s，弃上清，取细胞沉淀，剧烈振荡混匀；②在细胞沉淀中继续加入细胞裂解液300 μl，充分混匀，置于37℃的水浴锅中恒温加热1 h，若无团块则直接冷却至室温，若有团块需再次加入细胞裂解液100 μl，继续于37℃的水浴锅中恒温加热1 h，细胞沉淀完全溶解后，冷却至室温；③取 100 μl溶解后的沉淀液加入 300 μl细胞裂解液，充分振荡15 s，13 000 r/min高速离心3 min；④弃上清，在细胞沉淀物中加入300 μl异丙醇，摇晃混匀，再次13 000 r/min高速离心1 min；⑤弃上清，在细胞沉淀物中加入300 μl 70%乙醇，摇晃混匀，13 000 r/min高速离心3 min；⑥弃上清，沉淀残渣干燥15 min；⑦干燥后的沉渣中再次加入100 μl DNA水化液，置于65℃水浴锅中恒温加热1 h，所得DNA溶液置于-20℃条件下保存。

1.3.4 PCR引物CALR正向引物：5'-AGGCATACGCTGAGGAGT-3'，CALR反向引物：5'-GGGACAGAGGCAAGAAAA-3'。

1.3.5 PCR扩增条件94℃预热5 min；94℃变性30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循环35次；72℃延伸10 min。

1.3.6 基因测序 对经琼脂糖凝胶电泳后有条带显示样本的PCR产物剩余部分进行纯化，采用基因测序仪对PCR产物进行测序，并采用Mutation Surveyor软件对测序结果进行分析，确定基因突变的类型。

1.4 骨髓细胞学涂片与骨髓活检病理切片检测

全部标本均行骨髓细胞学涂片和骨髓活检病理切片检测，观察骨髓切片中CALR基因野生型[CALR（-）]和 CALR基因突变型[CALR（+）]巨核细胞的形态差异。将骨髓巨核细胞形态分为Ⅰ型（单个核型）、Ⅱ型（多个核型）、Ⅲ型（多分叶核型）、Ⅳ型（分叶不好型）、Ⅴ型（大核小核型）、Ⅵ型（巨核细胞簇）、Ⅶ型（骨小梁旁型）。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验、Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CALR基因突变类型和频率

本研究中PV患者无CALR突变，ET患者CALR突变阳性率为30.8%，PMF患者CALR突变阳性率为30.0%。ET患者和PMF患者中CALR突变主要以Ⅰ型和Ⅱ型居多（表1）。ET患者和PMF患者的CALR基因突变情况相近，因PMF患者较少，后续研究均只对ET患者进行统计学分析。

2.2 ET患者CALR基因突变巨核细胞形态

CALR（+）与CALR（-）ET患者的巨核细胞形态比较，差异无统计学意义（χ2=0.099，P＞0.05）。（表2）

2.3 CALR（+）与CALR（-）ET患者临床特征的比较

CALR（+）与CALR（-）ET 患者年龄、白细胞计数、血红蛋白水平及发现病因、症状体征情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；CALR（-）ET患者的血小板计数水平明显低于CALR（+）患者，差异有统计学意义（t=6.232，P＜0.01）。（表3）

表1 PV、ET、PMF患者中CALR基因突变类型和频率[ n（%）]*

表2 CALR（+）与CALR（-）ET患者的巨核细胞形态[ n（%）]*

表3 CALR（+）与CALR（-）ET患者临床特征的比较

3 讨论

MPN是一种常见的血液系统疾病，该病的发病率逐年升高且趋于年轻化，因此提高MPN的诊断和个体化治疗水平具有重要的临床意义。近年来，相比其他血液肿瘤的研究进展，MPN的研究进展缓慢，目前仅JAK2和MPL可作为诊断MPN的特异性分子标志物，虽然JAK2和MPL突变的发现提高了对部分MPN的诊断水平，但依然有近半数的PMF和ET患者缺乏特异性的诊断标志物[6]。2013年的一项研究证实，部分JAK2V617F、MPL突变双阴性的ET和PMF患者存在CALR基因第9外显子体细胞突变[7]。国内也有相关研究指出，CALR基因在野生型JAK2的PMF和ET患者中表现出重现性的插入和缺失[4]。

CALR是一种多功能蛋白质，普遍存在于细胞内质网中，由N-结构域、P-结构域、C-结构域以及9个外显子组成，其主要作用是调节体内钙动态平衡，可参与细胞增殖、凋亡、细胞吞噬、纤维化等一系列过程[8]。人类CALR基因位于第19号染色体，由9个外显子和8个内含子组成，CALR基因突变主要为第9号外显子插入或缺失，CALR基因突变造成了碱基对读码框移位，从而产生一种缺乏内质网保留序列的新型C-羧基末端蛋白。CALR基因突变类型多种多样，目前临床上已经证实存在55种以上的CALR基因突变，临床上对CALR基因的研究尚未深入。Vannucchi等[9]对携有CALR基因突变的骨髓标本进行免疫组织化学检测，发现免疫染色主要定位于巨核细胞，该研究提示巨核细胞在CALR突变的MPN发病机制中发挥了重要作用，但具体的发病机制并不清楚，仍有待进一步研究。

本研究发现，PV患者无CALR突变，ET患者CALR突变阳性率为30.8%，PMF患者CALR突变阳性率为30.0%。Tefferi等[10]对1107例MPN患者进行CALR检测，发现ET和PMF患者中的CALR突变阳性率分别为25%和35%。上述研究与本研究结果相一致，提示CALR基因突变检测有望成为ET、PMF等疾病的特异性分子标志物，为提高MPN的检出率做出贡献。本研究还发现，ET和PMF患者中CALR突变主要以Ⅰ型和Ⅱ型居多，与临床共识相一致。CALR（+）与CALR（-）ET患者的巨核细胞形态比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示CALR基因突变对巨核细胞形态无明显影响。通过比较CALR（+）与CALR（-）ET患者的临床特征发现，CALR（+）与CALR（-）患者年龄、白细胞计数、血红蛋白水平及发现病因、症状体征情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；CALR（-）患者的血小板计数水平明显低于CALR（+）患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。上述结果显示，CALR突变阳性与ET患者的症状体征、发现病因、年龄、部分外周血象均无关，但与血小板计数有关，与全铋[4]和丁莉[11]的研究结果相近。但有关研究显示，CALR基因突变患者相对于其他基因突变患者的血小板计数更高，且较少出现血栓和出血[12]。因此，结合本研究中CALR基因突变的ET患者血小板计数更高，提示CALR基因9号外显子突变对血小板计数有一定影响，CALR基因突变与血栓低风险可能有关，患者可能具有较长的生存期。同时提示CALR可能在ET和PMF中特异性表达，对于预测部分MPN的发生、发展、预后等方面具有至关重要的作用。

多年来，尽管临床上对MPN的研究不断深入，但CALR基因突变对MPN发病的影响机制至今尚不明确。Nangalia等[7]认为CALR突变会造成C端酸性结构域、部分钙结合位点及KDEI结构域缺失，引起CALR的功能发生变化，CALR突变后或许可通过巨噬细胞介导的免疫逃逸、干扰折叠蛋白反应、激活钙通道信号等一系列反应对MPN的发生、发展起到促进作用。另有学者认为，CALR可与肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）家族成员FASL结合形成复合体，介导细胞凋亡，一旦CALR基因突变，可能会影响细胞促凋亡系统[13]。最新的研究发现，CALR突变可诱导JAK2下游的一个靶调控点信号转导和转录激活因子5（signal transducers and activators of transduction 5，STAT5）活化，激活白细胞介素-3（interleukin-3，IL-3）依赖细胞株BA/F3自主增殖[14]。上述因素均可能会影响MPN的发生和发展。本研究存在一定的局限性，由于PMF患者例数的限制，本研究仅对ET患者进行了相关研究，CALR基因突变与PMF发生的关系将在后续临床研究中不断完善和补充。综上所述，CALR突变是继JAK2、MPL突变后的又一重大发现，其在JAK2、MPL突变双阴性的ET和PMF患者中存在，不仅可能成为MPN的分子标志物，同时也为疾病的发病机制和治疗提供了新思路，CALR有望成为新的MPN分子靶向目标。