乳腺癌内分泌治疗对髓系抑制性细胞的影响

毛启新，孙亚冬，张崇建，刘山青，李永，申衍，李连方

郑州大学附属肿瘤医院乳腺科，郑州4500080

中国乳腺癌的发病率居高不下，严重影响患者的健康。免疫微环境对于肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要的影响，其中髓系抑制性细胞（myeloidderived suppressor cell，MDSC）因其免疫抑制作用、固有性影响和适应性免疫反应引起较大关注，报道较多[1-2]。作为重要的全身治疗方法之一，内分泌治疗在雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性和（或）孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性乳腺癌患者术后辅助治疗、复发转移治疗和术前新辅助治疗中发挥重要的作用[3-4]。既往文献报道，无论是选择性ER调节剂他莫昔芬，还是芳香化酶抑制剂来曲唑，均可影响肿瘤微环境中的特定免疫成分[5-6]，但对于MDSC的作用尚缺乏报道。因此，本研究分析了乳腺癌内分泌治疗药物对MDSC的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年8月至2016年8月于郑州大学附属肿瘤医院接受术后辅助治疗的53例乳腺癌患者。纳入标准：①经术后病理组织学检查确诊为乳腺癌；②接受过乳腺癌改良根治手术或保乳手术治疗；③术后均接受过蒽环序贯紫杉类药物化疗；④术后病理免疫组织化学检测ER和（或）PR阳性，需接受内分泌治疗；⑤对本研究知情同意，并签署知情同意书。排除标准：患者不能配合研究。根据纳入、排除标准，共纳入53例患者，均为女性；年龄为42～82岁，平均年龄为（57.28±10.48）岁；肿瘤直径为1.29～9.04 cm，平均肿瘤直径为（4.52±1.59）cm；阳性腋窝淋巴结数量为1～6枚，平均数量为（3.25±1.27）枚。采用简单随机化分组法将53例患者随机分为他莫昔芬组（他莫昔芬治疗）22例和来曲唑组（来曲唑治疗）31例。他莫昔芬组患者的平均年龄为（59.86±11.85）岁；平均肿瘤直径为（4.56±1.89）cm；平均阳性腋窝淋巴结数量为（3.50±1.26）枚；病理类型：浸润性导管癌15例，浸润性小叶癌5例，其他2例；临床分期：0～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期6例。来曲唑组患者的平均年龄为（55.45±9.15）岁；平均肿瘤直径为（4.49±1.37）cm；平均阳性腋窝淋巴结数量为（3.06±1.26）枚；病理类型：浸润性导管癌22例，浸润性小叶癌7例，其他2例；临床分期：0～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期8例。两组患者的平均年龄、平均肿瘤直径、平均阳性腋窝淋巴结数量、病理类型、临床分期比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会批准备案。

1.2 治疗方法

根据中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2017年版）[7]，对ER和（或）PR阳性的患者应用内分泌药物进行治疗，药物包括他莫昔芬（10 mg，口服，每天2次）和来曲唑（2.5 mg，口服，每天1次）。

1.3 流式细胞术检测及分选MDSC

抽取入组患者内分泌治疗前外周血进行流式细胞术检测，确定基线数据；内分泌治疗6个月后，再次检测外周血MDSC，从而明确他莫昔芬和来曲唑对乳腺癌患者MDSC数量和功能的影响。应用氯化铵溶液裂解红细胞，离心后移除上层清液，使用Hanks液重悬细胞沉淀，调整浓度至2×107/ml。将50 μl细胞悬液与荧光抗体混匀，暗室低温孵育30 min，Hanks液游离抗体后上机检测或分选。检测或分选MDSC所用流式荧光抗体均购于美国BD公司，包括APC-CD33、Pacific blue-CD45和Per-CP-CY5.5-HLA-DR。

1.4 MDSC功能鉴定

应用体外培养体系分析MDSC对T细胞增殖的影响。常温环境中，应用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（carboxfluorescencein diacetate succinimidyl ester，CFSE）标记外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），反应10 min后Hanks液洗涤。已标记的PBMC接受植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）刺激，单独培养或与分选获得的MDSC共培养72 h。未加MDSC即为阳性对照。培养结束后，依据CFSE荧光强度判断T细胞的增殖程度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；计数资料以例数表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血MDSC相对数、绝对数比较

内分泌治疗前，他莫昔芬组与来曲唑组患者的MDSC相对数、绝对数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗6个月后，他莫昔芬组与来曲唑组患者的MDSC相对数、绝对数均明显低于本组治疗前，差异均有统计学意义（t=14.623、18.883，P＜0.01；t=14.614、14.496，P＜0.01）；治疗6个月后，来曲唑组患者的MDSC相对数、绝对数均明显低于他莫昔芬组，差异均有统计学意义（t=6.477、3.539，P＜0.01）。（表1）

表1 两组患者内分泌治疗前及治疗 6个月后外周血MDSC的相对数、绝对数（± s）

表1 两组患者内分泌治疗前及治疗 6个月后外周血MDSC的相对数、绝对数（± s）

images/BZ_80_1292_1754_2246_1799.png相对数（%）绝对数（×106/ml）治疗前治疗6个月后治疗前治疗6个月后14.95±5.20 9.65±3.50 7.59±3.34 2.92±1.18 14.77±6.36 3.09±1.91 8.89±3.10 1.73±0.35）

2.2 T细胞增殖水平比较

他莫昔芬组与来曲唑组患者的外周血经MDSC处理后的CD3+T细胞的增殖水平分别为（30.25±4.94）%和（65.93±17.48）%，均明显低于本组未加MDSC的（73.98±10.58）%和（76.48±10.65）%，差异均有统计学意义（t=36.376、8.600，P＜0.01）；来曲唑组患者的外周血经MDSC处理后的CD3+T细胞的增殖水平明显高于他莫昔芬组，差异有统计学意义（t=18.694，P＜0.01）；两组未加MDSC的CD3+T细胞的增殖水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

在世界范围内，乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤。作为乳腺癌全身治疗的重要方法之一，内分泌治疗从20世纪70年代起用于临床肿瘤治疗，现阶段可用于乳腺癌术后辅助治疗、术前新辅助治疗及复发转移治疗。主要治疗药物包括他莫昔芬和芳香化酶抑制剂（阿那曲唑、来曲唑及依西美坦等），目前主要依据患者的月经情况选择药物。内分泌治疗可明显延长ER和（或）PR阳性乳腺癌患者的生存期并提高生活质量，但相当比例的患者仍出现疾病进展或复发，严重影响预后。在此过程中，自身免疫抑制发挥了重要作用，涉及多种固有性和获得性免疫系统组成成分[8-10]。本研究重点探讨常用的内分泌治疗药物对于具有免疫调节功能的MDSC的影响，结果提示他莫昔芬和来曲唑均可减少乳腺癌患者外周血MDSC的相对数及绝对数，并抑制其免疫抑制功能；两组比较，来曲唑作用更为显著。

肿瘤免疫微环境不仅包含效应性成分，抑制恶性肿瘤细胞局部侵袭和远处转移，还包含调节性成分，抑制效应性免疫反应，导致疾病进展[11]。此类研究既往主要围绕调节性T细胞进行，而近年来MDSC成为肿瘤免疫治疗领域的另一研究热点。MDSC为一类异质性髓系细胞亚群，由各阶段前体细胞和祖细胞共同构成[12]。粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等成熟髓系细胞由造血干细胞分化形成，多种病理过程均可抑制髓系细胞正常分化，导致造血干细胞异常分化，从而产生具有免疫调节功能的MDSC[13]。小鼠中，MDSC表达细胞表面分子CD11b和Gr1；而人体内MDSC缺乏特异性鉴定标志物，通常定义为同时表达CD11b和CD33的髓系细胞，同时不表达或低表达HLA-DR[14]。MDSC对多种免疫细胞有抑制作用，其中对T细胞的影响最为显著，可明显降低其增殖水平和分泌功能。MDSC参与肿瘤微环境的形成与维持，有助于乳腺癌细胞的免疫逃逸，导致肿瘤局部侵袭和远处转移。Mikyšková等[15]发现，MDSC 水平与外周血循环肿瘤细胞数量相关，晚期乳腺癌患者外周血MDSC水平明显高于早期患者，且MDSC与患者生存时间呈负相关。这一结果提示MDSC水平及功能与肿瘤负荷有关，可作为新型生物标志物预测患者的肿瘤复发风险和评估预后。

对于药物与乳腺癌MDSC的相互作用，国内外均有文献报道。Kusmartsev等[14]利用荷瘤小鼠模型进行研究，发现全反式维甲酸通过直接抗肿瘤作用和抑制集落刺激因子释放的间接机制影响MDSC的分化和肿瘤内蓄积。Mikyšková等[15]检测环磷酰胺处理后的MDSC的免疫抑制功能，结果显示MDSC的免疫抑制功能显著提高，提示环磷酰胺对MDSC具有诱导作用。在荷瘤小鼠模型中应用舒尼替尼可明显减少脾脏MDSC数目，有助于免疫重塑[16]。雷帕霉素对MDSC的诱导[16]和抑制[17]作用均有文献支持，尚无统一结论。由此可见，不同药物对MDSC的影响差异较大，且非人体试验数据，无法指导临床用药。本研究进行临床观察性试验，在国内尚属首次，具有较大学术创新意义和临床推广价值。本研究发现乳腺癌内分泌治疗药物他莫昔芬和来曲唑均可抑制MDSC的扩增和激活，减少MDSC数量及抑制其功能。上述两种药物已成为最为常见的乳腺癌内分泌治疗药物，之前研究主要从杀伤肿瘤细胞的能力和降低不良反应的发生率方面比较不同药物的优劣，为临床决策提供循证医学证据。本研究结果显示，相对于他莫昔芬，来曲唑具有更显著的免疫调节作用，以及抑制MDSC聚集及其功能的作用，重塑免疫微环境可能对于肿瘤的控制具有积极的意义，最终延长患者生存期，提高生活质量。围绕他莫昔芬和来曲唑等药物对MDSC的调节机制，结合上述文献，提出假设，内分泌治疗药物可能会直接抑制MDSC扩增及激活，或通过相关细胞因子间接作用，诱导MDSC内自噬和凋亡水平升高。在接下来的工作中，计划借助离体细胞或整体动物模型对此加以研究和分析。综上所述，对于乳腺癌术后辅助内分泌治疗患者，他莫昔芬和来曲唑均可明显减少患者外周血MDSC的数量，并降低其功能，而两者相比，来曲唑的作用更为显著。这将拓展对乳腺癌肿瘤微环境的理解，并为治疗药物的精准选择提供循证医学证据。