HDGF、NET- 1、HDAC 1在肺癌患者肺癌组织中的表达及临床意义

王少青，张玉萍，许枫，黄春雷，代先慧#青岛市城阳区人民医院呼吸内科，山东 青岛66000

2青岛市肿瘤医院放疗科，山东 青岛2660000

肺癌作为威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一，在男性和女性肿瘤中的发病率分别居第1位和第3位[1]，肺癌的病死率在全球范围内肿瘤中居第1位，尤其在中国，肺癌的病死率呈逐年升高趋势。随着医学技术的不断发展，放化疗等治疗能够改善肺癌患者的生存情况，但是患者的5年生存率仍未超过20%[2]。肺癌的发生是由多种因素综合作用的，其中肿瘤细胞增殖在其中发挥重要作用[3]。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，研究者倾向于从分子生物学机制中探索肺癌的发生及发展过程，从而改善肺癌患者的生活质量，提高患者的远期生存率[4-5]。相关研究表明，肝癌衍生生长因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）与肺癌的发生、发展密切相关[6]；NET-1是四聚体超家族成员之一，主要参与细胞的黏附、增殖及分化等，与恶性肿瘤细胞的增殖密切相关[7]；组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylases 1，HDAC1）是哺乳动物的第1个组蛋白去乙酰化酶，在组蛋白乙酰化水平的调控过程中发挥重要作用[8]。本文探讨了肺癌患者肺癌组织中HDGF、NET-1和HDAC1的表达水平及其与肺癌患者临床特征的关系，旨在为肺癌的治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月至2016年12月青岛市城阳区人民医院收治的肺癌患者。纳入标准：①经组织病理学检查确诊，并经过计算机断层扫描（computed tomography，CT）及B超辅助诊断；②接受根治性手术治疗；③病历资料完整。排除标准：①合并心、肺、肾等重大脏器病变者；②精神、意识障碍者；③处于特殊时期，如妊娠期或哺乳期；④术前接受放化疗者；⑤术后生存时间小于3个月者。根据纳入和排除标准，本研究共选取肺癌患者126例。其中，男82例，女44例；年龄30～76岁，平均（59.62±3.27）岁；≥60岁68例，＜60岁58例；有吸烟史59例，无吸烟史67例；病理分型：腺癌43例，鳞癌55例，小细胞癌28例；分化程度：高中分化51例，低分化75例；TNM分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期29例，Ⅲ期28例，Ⅵ期24例；有远处转移62例，无远处转移64例；有血管浸润41例，无血管浸润85例。收集肺癌患者的肺癌组织标本和对应的癌旁正常组织（距肿瘤组织2 cm以上）标本各126例。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人HDGF多克隆抗体、兔抗人NET-1多克隆抗体及兔抗人HDAC1多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）免疫组织化学染色试剂盒和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DMI6000B型Leica全自动显微镜购自德国徕卡公司。

1.3 免疫组织化学染色

取肺癌组织标本和癌旁正常组织标本，置于4%的甲醛溶液中固定，常规脱水后使用石蜡进行包埋和切片，采用免疫组织化学SP法进行染色。首先，将石蜡标本切成4 μm的连续切片，并平铺在3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷处理过的载玻片上，于60℃烤箱中加热4 h，进行常规脱蜡，滴加30 ml 3%双氧水孵育10 min，从而消除内源性过氧化物酶的活性；使用蒸馏水漂洗样本，置于磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中，加热修复抗原；在标本中加入5%的正常山羊血清，在37℃下封闭10 min，然后滴加HDGF多克隆抗体（1∶12 500）、NET-1多克隆抗体（1∶20）和HDAC1多克隆抗体（1∶100），37℃条件下，在湿盒中孵育1 h，接着使用PBS漂洗；使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶孵育10 min，PBS漂洗10 min。使用色源底物溶液孵育10 min，再用蒸馏水漂洗；使用DAB显色，再用苏木精复染，最后进行常规脱水、透明和封片。

1.4 观察指标及判定标准[2,7-8]

比较肺癌组织和癌旁组织中HDGF、NET-1和HDAC1的表达水平，并对HDGF、NET-1、HDAC1表达水平与肺癌患者临床特征的关系进行分析；分析肺癌组织中HDGF、NET-1、HDAC1表达与肺癌患者TNM分型、分化程度及远处转移情况的相关性，以及肺癌患者肺癌组织中HDGF、NET-1、HDAC1表达的相关性。

免疫组织化学染色结果判定：HDGF以细胞核呈棕黄色或黄色颗粒分布为阳性表达，NET-1以细胞质或细胞膜呈棕黄色或黄色颗粒分布为阳性表达，HDAC1以细胞核呈棕黄色或黄色颗粒分布为阳性表达。由两名经验丰富的病理科医师在高倍镜（×400）下随机选择每个切片中的10个不重复视野进行阅片。采用半定量计分法计算肿瘤细胞的染色强度和阳性细胞所占比例。染色强度：1分，淡黄色；2分，黄色；3分，棕黄色。阳性细胞所占比例：0分，≤5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，≥76%。以两项评分的乘积为评价标准：0分，为阴性（-）；1～4分，为弱阳性（+）；5～8分，为中等阳性（++）；9～12分，为强阳性（+++）。本研究以（+）～（+++）作为阳性表达，（-）作为阴性表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示；采用Spearman等级分析进行相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HDGF、NET- 1和HDAC 1阳性表达率的比较

肺癌组织中HDGF、NET-1和HDAC1的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同组织中HDGF、NET- 1和HDAC 1阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 肺癌组织中HDGF、NET- 1和HDAC 1的阳性表达情况与肺癌患者临床特征的关系

吸烟、分化程度为高中分化、TNM分期为Ⅲ～Ⅵ期、有远处转移肺癌患者肺癌组织中HDGF、NET-1、HDAC1的阳性表达率均明显高于未吸烟、分化程度为低分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无远处转移肺癌患者，差异均有统计学意义（χ2HDGF=8.740、17.117、7.660、19.967，PHDGF＜0.01；χ2NET-1=12.286、16.846、14.681、14.975，PNET-1＜0.01；χ2HDAC1=6.909、15.856、20.181、17.362，PHDAC1＜0.01）。不同性别、年龄、病理分型、血管浸润情况肺癌患者肺癌组织中HDGF、NET-1和HDAC1的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征肺癌患者肺癌组织中HDGF、NET- 1和HDAC 1的阳性表达情况

2.3 肺癌组织中HDGF、NET- 1和HDAC 1的阳性表达率与肺癌发展的相关性分析

Spearman等级分析结果显示：肺癌组织中HDGF的阳性表达率与肺癌患者的TNM分期、分化程度及远处转移情况均呈正相关（r=0.708、0.689、0.719，P＜0.05）；肺癌组织中NET-1的阳性表达率与肺癌患者的TNM分期、分化程度及远处转移情况均呈正相关（r=0.717、0.705、0.698，P＜0.05）；肺癌组织中HDAC1的阳性表达率与肺癌患者的TNM分期、分化程度及远处转移情况均呈正相关（r=0.702、0.721、0.729，P＜0.05）。

2.4 肺癌组织中HDGF、NET- 1和HDAC 1阳性表达率的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示：肺癌组织中HDGF的阳性表达率与NET-1和HDAC1的阳性表达率呈正相关（r=0.698、0.727，P＜0.05）；肺癌组织中NET-1的阳性表达率与HDAC1的阳性表达率呈正相关（r=0.709，P=0.033）。

3 讨论

癌基因和抑癌基因表达水平异常时，可能导致细胞增殖的转录基因异常表达，使细胞的分化和增殖过程发生异常，细胞间信号转导异常使得细胞增殖周期发生变化，甚至凋亡程序消失[9]。HDGF最初是由Nakamura在1994年从HuH7肺癌细胞系培养液中分离出来的肽类物质，HDGF在多种类型肿瘤中的表达水平异常升高，如肺癌、食管癌、胰腺癌等，并且与肿瘤的转移及预后密切相关[10]。HDGF由240个氨基酸残基组成，包括6个外显子和5个内含子，定位于1q21-q23，主要存在于细胞核内，通过PWWP结构域与DNA结合发挥功能转录因子的功能[2]。随着对HDGF的深入研究，发现其广泛存在于正常组织和肿瘤组织中，在细胞增殖、血管生成、胚胎发育及细胞凋亡过程中发挥重要作用，而且HDGF的表达具有时相性，主要在器官发育早期表达，细胞分化程度越高，其表达水平越高，HDGF既可以在细胞质中表达，又可以在细胞核中表达[11]。四聚体超家族含有4个疏水性跨膜结构域的蛋白，构成细胞外两个环状结构，氨基和羧基位于细胞质内，各分子间的序列高度保守，并且跨膜区域内包括大部分的同源序列，NET-1作为4个跨膜区域蛋白超家族成员之一，是一种肿瘤增殖相关蛋白，定位于1p34.1，mRNA全长为1297 bp，开放阅读框包括241个氨基酸，参与细胞信号的转导及细胞的黏附、增殖、分化过程，NET-1在恶性肿瘤的表达水平异常升高，如肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌等[12]。组蛋白的修饰过程包括乙酰化、磷酸化和甲基化，乙酰化是影响基因转录的重要机制，而组蛋白的乙酰化过程受HDAC的调节[8]，组蛋白的乙酰化和去乙酰化对肿瘤的发生、发展具有重要作用，HDAC共有4种类型，主要通过修饰组蛋白调节基因或转录因子表达，HDAC1属于Ⅰ型HDAC，是第1个与哺乳动物相关的组蛋白去乙酰化酶，包括482个氨基酸[7,13]。

本研究对肺癌组织与癌旁正常组织中HDGF、NET-1和HDAC1的表达水平进行检测，结果发现，肺癌组织中HDGF、NET-1、HDAC1的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织（P＜0.01），提示HDGF、NET-1和HDAC1可能作为诊断肺癌的有效生物学指标。同时本研究还发现，不同吸烟史、分化程度、TNM分期及远处转移情况肺癌患者肺癌组织中HDGF、NET-1、HDAC1的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），并且HDGF、NET-1、HDAC1的阳性表达率均与肺癌患者的TNM分期、分化程度及远处转移情况呈正相关（P＜0.05），表明HDGF、NET-1和HDAC1与肺癌的发生、发展关系密切。HDGF能够通过加速胚胎细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞的增殖和生长速度，提高内皮细胞和血管平滑肌细胞的迁移速度，促进新血管生成[14]。NET-1与细胞黏附因子协同作用影响黏附依赖性下游信号，激活酪氨酸激酶的磷酸化，加速细胞的分裂，同时减缓细胞凋亡速度[15]。HDAC1与多种影响细胞分化、增殖的转录因子直接作用，敲除HDAC1的细胞增殖活性下降，凋亡过程减慢，是由于HDAC1影响分子复合物的结构完整性和功能性，最终影响肺癌细胞的增殖和凋亡过程[16]。另外HDAC1调控周期蛋白依赖性激酶的表达水平，同时使肿瘤细胞的增殖活动停止在G1期，阻滞肿瘤细胞的凋亡，干扰肺癌细胞中下调信号相关蛋白ErbB2的表达和细胞外信号调节激酶1的活性，并且降低端粒酶活性[17]。吸烟导致肺癌的发生，主要是因为吸烟过程中烟草产生大量的致癌或促癌物质，导致肺癌的发生及发展，从而提高相关蛋白的表达水平[5]。本研究对上述3种指标的相关性进行研究，结果发现肺癌组织中HDGF、NET-1和HDAC1的阳性表达率间均呈正相关（P＜0.05），推测主要是由于上述3种指标通过影响肿瘤细胞的增殖和血管生成过程而相互影响。

综上所述，肺癌组织中HDGF、NET-1和HDAC1的阳性表达率异常升高，并且与肺癌的发展密切相关，同时应戒烟以预防或减缓肺癌进展，HDGF、NET-1和HDAC1 3种分子生物学指标的临床意义重大，值得临床推广应用。