HA-CD44st-TGF- β信号通路对乳腺癌MCF- 7细胞HER 2表达及侵袭能力的影响△

耿鹤，陆颖芝，陈谦，徐静，严海翠，马兆明，黄关宏#，房新建#1蚌埠医学院研究生院，安徽 蚌埠33030

2蚌埠医学院附属连云港医院/连云港市第二人民医院肿瘤科，江苏 连云港 2220230

分化抗原簇44st（cluster of differentiation antigen 44st，CD44st）是透明质酸（hyaluronic acid，HA）受体CD44家族成员之一，人类CD44基因位于人类11号染色体短臂上，完整基因组在染色体DNA上长约50 kb。CD44分子可以通过与细胞骨架蛋白的相互作用介导细胞内的信号转导。CD44分子不仅是肿瘤干细胞的标志物，还直接参与肿瘤的发生发展[1]。迄今为止，已发现20余种CD44亚型，最常见的CD44亚型为标准CD44（standard CD44，CD44s），由恒定区外显子1-5、16-18及20编码组成；其他常见的亚型为pMeta-1及pMeta-2[2]；从人乳腺癌MCF-7细胞多柔比星（adriamycin，ADR）耐药株中克隆出一种新的短尾形式CD44st，包含外显子1-4、16-17及18号外显子的1-205号碱基（基因库号：FJ216964）[3-4]。在转染 CD44st的MCF-7细胞中，HA可以与CD44st相互作用，通过促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，引起基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）分泌增加，进而增加其侵袭能力[3-4]；进一步研究显示，HA可以通过CD44st表达的上调，激活核因子кB（nuclear factor-kappa B，NF-кB），诱导多药耐药细胞增加MMP2和MMP9的分泌，影响肿瘤细胞的侵袭能力[5]。

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在不同的细胞生长环境中可以表现为抑制或者促进乳腺癌的进展。在乳腺癌早期，TGF-β可以抑制肿瘤细胞的增殖；而在乳腺癌进展期，由于肿瘤细胞对TGF-β抑制因子的抗拒，TGF-β促进了肿瘤的转移。目前尚不清楚TGF-β在肿瘤中的双重作用机制，但研究表明TGF-β能否与TGF-β受体1（TGF-β receptor 1，TGF-βR1）、TGF-β受体2（TGF-β receptor 2，TGF-βR2）结合，在上述信号级联转导中起关键作用[6-8]。TGF-β以前体的形式合成，裂解附近的羧基末端，释放潜在型结合肽（latency associated peptide，LAP），LAP结合成熟型TGF-β同源二聚体，促进潜在型TGF-β结合蛋白（latent TGF-β binding protein，LTBP）的黏附，这种潜在型TGF-β/LAP/LTBP复合物使TGF-β处于失活状态，不能与TGF-βR结合[9]。

研究显示，在HA-CD44介导的信号通路中，TGF-β是其下游信号转导通路中的靶蛋白之一，HA受体CD44介导TGF-β1诱导的细胞增殖反应，与HA表达上调共同促进表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）与CD44耦合，并加强了MAPK通路中细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路信号的转导[10]；应用HA预处理CD44阳性表达的MCF-7-B5细胞株后，TGF-β2蛋白表达明显上调，且TGF-β2蛋白表达的上调与肿瘤细胞的侵袭能力密切相关[11]。

人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性的乳腺癌患者占全部乳腺癌患者的15%～20%，由于HER2阳性乳腺癌的侵袭及转移能力强，因此患者预后较差[12]；临床上应用具有抗HER2作用的曲妥珠单抗可以降低术后或晚期患者的复发率，延长生存时间[13-14]。研究显示，在MCF-7细胞中HA-CD44介导了CD44与人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER）家族成员的相互作用，引起透明质酸合成酶-2或者基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）过表达，导致HER2蛋白的磷酸化水平升高[15]。此外，由HA引起的CD44-HER2复合物激活，可以导致肿瘤细胞恶性程度增加，加上HA在细胞膜表面的作用，最终引起肿瘤细胞对曲妥珠单抗的耐药[16-17]。

鉴于以上研究结果，为了明确肿瘤耐药细胞株MCF-7/ADR中CD44st基因对肿瘤侵袭能力及耐药的作用，有必要研究HA-CD44st信号通路对TGF-β表达的影响，以及上述通路对下游磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）信号通路分子活性及HER2基因表达的影响，并探讨上述通路对肿瘤细胞侵袭能力的影响，旨在为针对CD44st、TGF-β的靶向治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

乳腺癌细胞株MCF-7、乳腺癌耐ADR细胞株MCF-7ADR均购自中国科学院上海细胞库。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、总RNA抽提试剂（Trizol）、Opti-MEMⅠ减血清培养基（Opti-minimal essential medium-Ⅰ reduced serum medium，OPTI-MEMⅠ）、LipofectamineTM2000转染试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ、KpnⅠ均购自美国NEB公司。石蜡包埋组织RNA提取试剂盒（k1560-2）及逆转录cDNA合成试剂盒（K1622）均购自美国NEB公司。HA、T4连接酶、高保真Taq酶、1640培养基、pMD19-T载体（6013）、Taq DNA 聚合酶（RR066B）、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（RR066B）均购自日本TaKaRa生物有限公司。TGF-β抗体（3711）、HER2抗体（2242）、PI3K抑制剂LY-294002（9901）、PI3激酶Ⅱ类兔单克隆抗体、Phospho-NDRG1（Ser330）（D3A12）兔源单克隆抗体、兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）抗体及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-PKB/p-AKT）抗体均购自美国CST公司。Transwell购自美国Corning公司。Matrigel购自美国BD公司。鼠抗人CD44单克隆抗体（14-0441）购自美国Affymetrix公司。明胶酶谱试剂盒购自北京普利莱基因技术公司。真核表达载体pcDNA3.1由江苏大学基础医学和医学技术学院许文荣教授惠赠。

1.2 实验方法

1.2.1 CD44基因转染及其表达的检测 转染前1天接种MCF-7细胞于6孔板（3.5×105/孔）中。实验分为阴性对照组（MCF-7）、转染空载体组（MCF-7/neo）和转染CD44st组（MCF-7/CD44st），参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行操作。转染48～72 h后，收集细胞，采用RT-PCR和流式细胞术分别检测CD44 mRNA和CD44蛋白的表达[3-4]。

1.2.2 HA处理转染细胞 实验共设MCF-7组、MCF-7+HA组、MCF-7/neo组、MCF-7/CD44st组、CD44封闭性单抗预处理组、MCF-7/CD44st+HA组6组。将对数生长期的MCF-7细胞分别转染重组质粒载体 pcDNA3.1-CD44st和 pcDNA3.1，24 h后移去转染混合液，加入含10%热灭活胎牛血清1640培养基。于转染45 h后，消化、离心并收集各组细胞。分别计数1.5×106个细胞，将其接种于各实验组的细胞培养瓶中，在培养瓶中加入1.5 ml无血清1640培养基。CD44封闭性单抗预处理组加入CD44封闭性单抗20 μg/ml预处理3 h。在转染48 h后，MCF-7+HA组、MCF-7/CD44st+HA组和CD44封闭性单抗预处理组分别加入HA 100 μg/ml孵育24 h。为了排除其他生长因子的干扰，HA于使用前在100℃水浴中煮沸5 min[4]。HA孵育24 h后，收集各组细胞进行RT-PCR检测。

1.2.3 RT-PCR检测CD44 st mRNA、HER 2 mRNA及TGF- β mRNA的表达 分别取MCF-7组、MCF-7+HA组、MCF-7/neo组、MCF-7/CD44st组、CD44封闭性单抗预处理组、MCF-7/CD44st+HA组细胞各1×106个，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR检测。采用引物设计软件Primer 5.0设计人CD44s（t基因库号：FJ216964）、TGF-β（基因库号：NM000660）及HER2（又称Cerb-B-2，基因库号：X03363.1）片段引物（表1）。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像仪对产物进行扫描，以β-actin为内参对照基因进行质控和标化。

表1 PCR引物序列

1.2.4 Westernblot检测TGF- β蛋白、HER 2、AKT和p-AKT表达 取上述MCF-7组、MCF-7+HA组、MCF-7/neo组、MCF-7/CD44st组、CD44封闭性单抗预处理组、MCF-7/CD44st+HA组细胞各1×106个。用煮沸的2×上样缓冲液60 μl收集各实验组细胞，100℃煮沸5 min变性，12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，1 mA/cm2恒流半干转膜，5%的脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，以GAPDH（1∶3000）作为内参，鼠抗人TGF-β、HER2、AKT和p-AKT抗体（1∶500）孵育，4℃过夜，用含1‰吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（tris buffered saline tween，TBST）洗膜3次，每次10 min，山羊抗鼠二抗（1∶2000）室温孵育1 h，TBST缓冲液充分漂洗，将膜蛋白面向上，加入电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂，2 min后于凝胶成像系统中曝光。

1.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力采用无血清1640培养基将Matrigel稀释（稀释浓度1∶1），每个Transwell小室加入150 μl上述混合物，37℃放置1 h。Matrigel充分聚合后，Transwell下室加入1000 μl含10%新生牛血清1640培养基，平衡1 h。实验共设MCF-7组、MCF-7/CD44st组、MCF-7/CD44st+HA组、CD44封闭性单抗预处理组、LY-294002预处理组5个实验组。0.25%胰蛋白酶消化并收集以上各组细胞，制备成1×105/ml细胞悬液，取200 μl细胞悬液，接种至Transwell上室，常规培养24 h。取出Transwell小室，用棉签拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）轻轻冲洗聚碳酸酯膜的上、下面，晾干，0.1%结晶紫染色10 min，去除多余结晶紫染液，普通光学显微镜下观察，每个滤膜随机选取5个200倍视野，计数穿膜细胞数量（聚碳酸酯膜下表面细胞数量），以穿膜细胞的数量表示肿瘤细胞的侵袭能力。实验重复3次。

1.2.6 EMSA检测AP- 1表达采用电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）检测激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）在HACD44st-TGF-β-PI3K信号转导通路中的作用，实验分组同1.2.5。计数3×106个MCF-7细胞，于转染前24 h接种于培养瓶中。转染24 h后移去转染混合液，加入含10%热灭活胎牛血清1640培养基，孵育12 h。转染36 h后，CD44封闭性单抗预处理组、LY-294002预处理组细胞分别用CD44单抗（20μg/ml）、LY-294002（50 μmol/L）预处理 3 h。于转染 39 h后，MCF-7/CD44st+HA组、CD44封闭性单抗预处理组、LY-294002预处理组细胞分别加入HA（100 μg/ml）处理6 h，设 MCF-7/CD44st组为阴性对照组。于转染45 h后，收集以上各实验组细胞6×106个，加入300 μl细胞质蛋白提取液Buffer A，冰上静置15 min；4℃，以2000 r/min离心10 min；弃上清，以Buffer A 100 μl洗涤沉淀；4℃，以5000 r/min离心10 min；弃上清，加入 Buffer B 100 μl，充分混匀后，冰浴静置10 min；再次混匀，冰浴静置10 min，如此反复2次；4℃，以15 000 r/min离心20 min；收集上清，此即为核蛋白提取液，取2 μl核蛋白，采用Bradford法测定核蛋白浓度，分装后-70℃保存。AP-1探针序列：5'-CGCTTGATGACTCAGCCG-GAA-3'，3'-GCGAACTACTGAGTCGGCCTT-5'。参见说明书依次进行探针的标记、结合反应、配胶、电泳、转膜，采用ECL法检测生物素标记的DNA，将膜置于胶卷盒中，于X线下显影。调整曝光时间，以获得合适的结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示；采用单因素方差分析转染组与阴性对照组的差异；多组间比较采用F检验；组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA 3.1-CD44 st重组质粒CD44 st的转染情况

RT-PCR检测结果显示，MCF-7细胞和MCF-7/neo细胞中均未见CD44st mRNA表达，而MCF-7/CD44st细胞中CD44st mRNA表达水平较高（图1）。流式细胞术检测结果显示，MCF-7细胞和MCF-7/neo细胞中仅有少量CD44阳性细胞，而MCF-7/CD44st细胞中CD44阳性细胞较多（图2）；另外，在MCF-7细胞、MCF-7/neo细胞和MCF-7/CD44st细胞中CD44阳性表达率分别为（7.9±1.5）%、（7.0±1.1）%和（73.1±2.9）%；MCF-7/neo细胞与MCF-7细胞的CD44阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而MCF-7/CD44st细胞的CD44阳性表达率与MCF-7细胞、MCF-7/neo细胞比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图1 RT-PCR检测各组细胞CD44 st的表达情况

2.2 CD44 st表达上调的MCF- 7细胞中HER 2、TGF- β表达情况

HA处理24 h后，MCF-7/CD44st+HA组细胞的HER2 mRNA、TGF-β mRNA及HER2、TGF-β蛋白较其他各组表达明显上调；与MCF-7组、MCF-7+HA 组、MCF-7/neo组比较，MCF-7/CD44st组及CD44封闭性单抗预处理组细胞的HER2 mRNA、TGF-β mRNA 及 HER2、TGF-β蛋白表达无变化。（图3）

2.3 HA处理后各组细胞中p-AKT的表达情况

经HA100μg/ml处理30 min后，转染pcDNA3.1-CD44st的MCF-7细胞中p-AKT表达增强；CD44封闭性单抗预处理组细胞的p-AKT表达明显弱于MCF-7/CD44st+HA组；与MCF-7组比较，MCF-7+HA组、MCF-7/neo组、MCF-7/CD44st组细胞p-AKT表达未见明显增强。（图4）

图2 流式细胞术检测各组细胞CD44的表达情况

图3 RT-PCR与Western blot分别检测各组细胞中CD44 st mRNA、TGF- β mRNA、HER 2 mRNA与CD44 st、TGF- β、HER 2蛋白的表达情况

图4 Western blot检测各组细胞中p-AKT的表达情况

2.4 转录因子AP- 1在HA-CD44st-TGF- β-PI 3 K信号转导通路中的表达情况

EMSA法检测转录因子AP-1与DNA的结合活力，结果发现，MCF-7组、MCF-7/CD44st组、CD44封闭性单抗预处理组、LY-294002预处理组、MCF-7/CD44st+HA组细胞的AP-1与DNA结合的荧光强度分别为750.7、1152.6、2261.8、3539.8、4967.3。MCF-7/CD44st+HA组细胞的AP-1与DNA结合的荧光强度明显强于其他各组，CD44封闭性单抗预处理组及LY-294002预处理组的AP-1与DNA结合的荧光强度强于MCF-7/CD44st组。（图5）

图5 EMSA检测转录因子AP- 1与DNA的结合活力

2.5 各组细胞的侵袭能力比较

Transwell侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力，结果发现，MCF-7组、MCF-7/CD44st组、CD44单抗预处理组、LY-294002预处理组和MCF-7/CD44st+HA处理组5个实验组侵袭细胞数量分别为（161±21）、（190±26）、（205±30）、（210±25）、（273±28）个/200倍视野。MCF-7/CD44st+HA组侵袭细胞数量多于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而MCF-7/CD44st组、CD44封闭性单抗预处理组及LY-294002预处理组侵袭细胞数量多于MCF-7组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。（图6）

图6 Transwell侵袭实验检测HA-CD44 st引起MCF- 7/CD44 st细胞侵袭力变化

3 讨论

上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一个复杂严密的调节过程，这种过程赋予上皮细胞以间叶细胞的活性[18]。在EMT过程中，这种细胞行为及特性的转换过程通常由EMT相关转录因子如nail/Slug和ZEB1/2协助完成，这些EMT相关转录因子的功能可促进上皮成分如锚蛋白的丢失，以及间叶蛋白如波形蛋白的产生，这些EMT转录因子可以被许多细胞因子或生长因子所激活，包括TGF-β等[19]。除EMT外，TGF-β信号通过经典的信号级联转导（如Smad蛋白家族中的Smad2、3），或者是非经典的信号级联转导，包括非Smad蛋白（如PI3K-AKT，细胞外信号相关蛋白激酶1、2）[20-21]控制细胞的生长分化、存活、凋亡及细胞外基质降解、血管生成、免疫系统等。

TGF-β家族成员表达（TGF-β1、TGF-β2）与HA-CD44信号转导及多种肿瘤的侵袭、转移密切相关。在乳腺癌及肺癌细胞中，TGF-β1通过HACD44反向激活EGF信号，诱导EMT表达，这一过程与肿瘤的发展密切相关，并影响肿瘤细胞的侵袭与转移[22-23]。TGF-β2是潜在的CD44下游转录基因，在CD44阳性表达的乳腺癌细胞MCF-7（B5克隆）中，HA预处理后TGF-β2的前体蛋白表达明显上调，而应用CD44 RNAi后TGF-β2表达明显下调，该研究表明TGF-β2是HA-CD44信号通路的下游靶基因，该信号通路与乳腺癌细胞的侵袭及耐药密切相关[11,24]。许多研究证实TGF-β2过表达促进了多种肿瘤的侵袭作用，如卵巢癌[25]、黑色素瘤[26]、胰腺癌[27]及皮肤癌[28]。本研究显示，HA与CD44st受体结合后，可以通过CD44st→TGF-β→PI3K信号转导通路调节MCF-7细胞的侵袭能力，与此同时伴有TGF-β、HER2表达的上调，提示TGF-β可能是HACD44st通路的下游信号蛋白之一，而这种信号之间相互作用对于HER2的表达及乳腺癌细胞株MCF-7细胞的侵袭能力产生了重要的影响。

有关CD44分子在乳腺癌中表达及意义的研究显示，在肿瘤进展过程中HA与广泛分布于细胞表面的CD44亚型结合，诱导细胞骨架蛋白、锚蛋白、小G蛋白Rho及PI3K-AKT通路的活化，导致乳腺癌细胞株MCF-7细胞的黏附、生长、增殖、迁移及侵袭能力的增加[29]，引起HER2阳性乳腺癌细胞株对曲妥株单抗的耐药[30]，并与肿瘤患者的不良预后密切相关[31-34]。HA与CD44的结合可以调节EGFR家族成员的活性[15]，HER2阳性的乳腺癌患者，血清CD44表达明显上调，该研究结果提示，CD44作为肿瘤预后的标志物的作用值得进一步研究，CD44可以作为曲妥珠单抗耐药患者的耐药逆转靶基因[35]。Bellerby等[36]的研究证实，CD44的过表达与雌激素耐药有关，促进了耐药细胞的侵袭能力；在雌激素敏感的MCF-7细胞中，CD44v6过表达可以通过EGFR信号通路的反向激活，增加肿瘤细胞的侵袭能力，减少对雌激素药物的反应性；针对CD44v6及EGFR的靶向治疗可以延缓或阻止乳腺癌的耐药。一项278例乳腺癌术后患者的研究显示，与HER2阴性组患者比较，HER2阳性组患者的乳腺癌细胞中HA表达及肿瘤间质细胞中CD44的表达明显上调，并且在基质细胞中CD44阳性、乳腺癌细胞中HER2阳性与受体阴性、肿瘤低分化密切相关，并影响乳腺癌术后患者的预后。该研究提示，肿瘤细胞中HER2的表达与HA、CD44的表达有密切的关系[37]。

综述所述，在乳腺癌细胞株MCF-7中，HA-CD44st的结合对TGF-β、HER2的表达及PI3K信号转导通路、AP-1转录因子的激活有重要的作用；信号通路HA-CD44st→TGF-β→PI3K的激活以及与TGF-β介导的信号转导分子的相互作用，影响乳腺癌细胞的生成、增殖及恶性表型的改变。本研究为针对CD44st、TGF-β以及上述通路的靶向治疗奠定了基础；同时为深入研究该信号通路对肿瘤的形成、多药耐药的作用、侵袭行为的改变指出了方向，进一步为CD44st基因单抗的研发及该基因在乳腺癌术后患者中表达意义的研究提供了可靠保证。