橙皮提取液合成载银石墨烯研究

谢东梅 徐 丹 任 丹

(西南大学食品科学学院，重庆 400715)

抗菌包装可通过与食品表面接触发挥抗菌作用，达到抑制食品在贮藏过程中的微生物生长，延缓腐烂变质并避免二次污染的目的。因此，抗菌包装的应用可有效防止食品在流通和销售过程中的微生物污染，延长食品的货架期，还可大大减少食品加工过程中化学添加剂的用量，并尽可能地保持食品的品质，增强食品的安全性，因此成为目前食品包装材料的研究热点之一。目前的抗菌包装材料大多是通过添加一定的抗菌剂，赋予其抗菌能力。纳米银(AgNPs)因其优异的抗菌性能和良好的安全性，成为医药和食品等领域最有应用潜力的抗菌填料之一[1]。已有研究表明，含AgNPs的保鲜膜可有效延长鸡蛋的货架期[2]，保持黄瓜的贮藏品质[3]，抑制南丰蜜桔果实霉菌的生长[4]，以及延长冷藏虾仁的保质期[5]等。但AgNPs尺寸较小，易发生迁移而导致安全隐患。如能将其进行固载或与其他材料复合则可降低其安全风险。

石墨烯(Graphene)因其绝佳的机械性能、耐热性和巨大的比表面积等优良性能被誉为21世纪“革命性材料”。将其加入有机高分子材料中，可大大增强高分子材料的力学性能、阻隔性和耐热性。而氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)含有大量的—OH和—COOH等含氧基团，可通过物理吸附、静电引力和电荷转移等相互作用吸附和固载Ag+，并通过还原剂将其还原为纳米银粒子(AgNPs)固载于GO片层表面，从而有效减少颗粒的迁移[6]，并可有效地抑制石墨烯在高分子基材中的团聚[7]，使其更好地发挥纳米增强作用。

采用天然还原剂如植物提取物等来制备纳米粒子及其复合物具有绿色安全等优点[8]，尤其适用于医药和食品领域的纳米粒子的合成。例如采用慈姑(Syzygiumcumini)种子提取物合成纳米金装饰的还原氧化石墨烯(rGO)[9]，采用松树叶提取液合成纳米银装饰的rGO[10]等都已被报道过。而橘皮作为世界主要水果之一柑橘的主要副产物，含有丰富的类黄酮、酚酸和VC等还原性成分，是优良的天然还原剂之一。但尚未有报道采用橘皮提取物来合成纳米银和石墨烯的复合物。本课题组[11]前期采用橘皮提取液成功合成了纳米银，并对橘皮种类进行了筛选。在此基础上，本研究拟采用澳橙果皮提取液作为还原剂及稳定剂，制备载银石墨烯(rGO-Ag)。通过单因素试验探究反应时间、反应温度和AgNO3浓度对rGO-Ag反应率、粒径大小及稳定性的影响。由此设计正交试验，以平均粒径作为考察指标，确定澳橙果皮提取液合成rGO-Ag的最优工艺，并对rGO-Ag的结构进行表征，以期为rGO-Ag在抗菌包装中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜澳橙(Citrussinensis)：重庆市北碚区永辉超市；

石墨粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

浓硫酸(质量分数为98%)、浓盐酸(质量分数37%)：优级纯，重庆川东化工(集团)有限公司；

双氧水(质量分数为30%)、硝酸银、氢氧化钠、高锰酸钾、硝酸钠、柠檬酸三钠：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

超纯水：实验室自制。

1.1.2 仪器与设备

冷冻干燥机：LGJ-10型，北京松源华兴科技发展有限公司；

冷冻离心机：Avanti-J-301型，美国贝克曼库尔特公司；

紫外分光光度计：UV-2450型，日本岛津公司；

马尔文粒度仪：Nano-ZS90型，英国马尔文公司；

透射电子显微镜(TEM)：JEM-1200EX型，日本电子公司；

傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)：Spectrun100型，美国Perkinelmer公司；

激光共聚焦显微拉曼(Raman)光谱仪：Scientific DXR2型，美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 果皮提取液的制备 将新鲜的澳橙洗净晾干，果皮剥下切成小块，装于自封袋中，置于-20 ℃冰箱冷藏备用。取50 g冷藏橙皮加入到300 mL超纯水中，用榨汁机打碎后倒入1 000 mL烧杯中，95 ℃水浴中搅拌20 min。冷却后用纱布过滤，去除橙皮渣。再将滤液以6 000 r/min 离心10 min。上清液抽滤以进一步去除提取液中的细小橙皮渣。制得的橙皮提取液置于4 ℃冰箱内待用。

1.2.2 GO的制备 参照改进的Hummers方法[12]。步骤如下：将2 g硝酸钠、2 g石墨粉和95 mL 98%浓硫酸添加到1 000 mL圆底烧瓶中混合后，超声波处理1 h。在冰水浴条件下800 r/min搅拌2 h。然后缓慢添加12 g高锰酸钾并在45 ℃水浴中继续搅拌2 h，再缓慢加入100 mL 超纯水。将混合液冷却10 h后，缓慢加入50 mL 30%过氧化氢溶液。自然冷却后，将所得混合物先用5%稀盐酸溶液多次离心清洗，再用超纯水反复离心清洗，直至离心所得上清液为中性。离心所得固体即为GO，用超纯水溶解后超声波处理2 h。标定GO浓度(6.8 mg/mL)后，置于冰箱4 ℃下保存备用。

1.2.3 rGO-Ag的合成 向150 mL锥形瓶中分别加入30 mL橙皮提取液，1 mL稀释至68 mg/LGO和1 mL 0.01 mol/L 柠檬酸钠，再加入20 mL一定浓度AgNO3溶液以及28 mL超纯水。超声0.5 h后，在不同温度下反应一定时间。待冷却后，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，将所得沉淀冷冻干燥(真空度<10 Pa，冷阱温度<-50 ℃)，即为rGO-Ag。

1.2.4 单因素试验设计

(1) 反应时间：以AgNO3浓度10 mmol/L，油浴温度90 ℃为基础条件。考察反应时间(1，2，3，4，5，6 h)对rGO-Ag反应率、粒径大小及稳定性的影响。

(2) 反应温度：以AgNO3浓度10 mmol/L，反应时间4 h为基础条件。考察油浴温度(70，80，90，100 ℃)对rGO-Ag反应率、粒径大小及稳定性的影响。

(3) AgNO3浓度：以反应时间4 h，油浴温度100 ℃为基础条件，考察AgNO3浓度(5，10，15，20，25，30 mmol/L)对rGO-Ag反应率、粒径大小及稳定性的影响。

1.2.5 正交设计试验优化 在单因素试验基础上，选取反应时间、温度、AgNO3浓度3个因素中的4个水平，以反应后稀释相同倍数反应液的平均粒径作考察指标，采用L16(45)的正交试验表头设计，以确定橙皮提取液还原制备rGO-Ag的最优条件。

1.2.6 rGO-Ag的表征

(1) 紫外—可见光谱测定：取适量用超纯水稀释后的rGO-Ag反应溶液于石英比色皿中，采用UV-2450紫外分光光度计进行扫描，波长范围200～800 nm。

(2) 粒径和Zeta电位测定：取1 mL超纯水稀释后的rGO-Ag反应溶液于粒径样品池中，用马尔文激光粒度仪测定rGO-Ag平均粒度值。另取上述稀释液1 mL至Zeta电位样品池中，测定溶液Zeta电位值。

(3) TEM分析：将少量GO、rGO及最优工艺条件制备得到的rGO-Ag粉末置于无水乙醇中，采用细胞粉碎仪进行高频超声分散，然后滴至铜网上，采用TEM对样品的表面形貌进行观察，并使用Image-ProPlus 6.0软件分析和统计rGO上负载的AgNPs的粒径大小。

(4) Raman光谱测定：取少量rGO、GO及最优工艺条件制备得到的rGO-Ag粉末分别置于载玻片上，将其压实后，利用激光共聚焦显微拉曼光谱仪在室温下进行Raman光谱测试。扫描波数范围50～2 500 cm-1，激发波长532 nm。

(5) FTIR光谱测定：将橙皮提取液、GO、AgNPs及最优工艺条件制备得到的rGO-Ag进行冷冻干燥得到粉末，采用KBr压片法制备样品，扫描波数范围400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1，扫描次数32次。

1.3 数据分析

数据均用Origin Pro 8.6作图，采用SPSS 18进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，结果以(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 反应时间的影响 由图1(a)可知，rGO-Ag在430 nm 左右有1个明显的吸收峰，与AgNPs表面等离子体共振峰一致[13]。随着反应时间的延长，该吸收峰的峰值不断增加，表明溶液中AgNPs浓度逐渐升高，反应率逐渐提高。但反应时间超过4 h后，增加速度减缓，说明反应逐渐达到饱和[10]。

由图1(b)可知，当反应时间从1 h增加至4 h时，rGO-Ag的平均粒径降低了41.2%。此时继续延长反应时间，平均粒径仍呈下降趋势，但下降不明显。可能是反应初期rGO尚未被完全分散，随着反应的进行，rGO上附着的AgNPs逐渐增多，且吸附了橙皮提取液中的果胶，使得生成的rGO-Ag能更好地分散，粒径减小[7, 9, 14]。纳米分散液的Zeta电位绝对值是衡量其在溶液中稳定性的一个重要指标。通常情况，当其绝对值高于30 mV，则认为该分散体系非常稳定[15]。rGO-Ag的Zeta电位为负值，表明其表面带负电荷，且绝对值均分布在25～27 mV，表明其在水相中能较为稳定地分散。同时，反应时间对rGO-Ag溶液的稳定性影响较小。

2.1.2 反应温度的影响 由图2(a)可知，随着反应温度的升高，rGO-Ag在430 nm处吸收峰的强度明显增加，说明反应温度对AgNPs的反应率有较大影响。且由图2(b) 可知，提高反应温度可显著降低rGO-Ag的平均粒径。可能是升高温度可加快反应速率[16]，并有利于AgNPs晶体成核[17]。但随着反应温度的提高，rGO-Ag溶液的Zeta电位绝对值略有下降。

大写字母不同表示Zeta电位绝对值差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示平均粒径差异显著(P<0.05)

图1 反应时间对rGO-Ag的影响

Figure 1 Effects of reaction time on rGO-Ag

2.1.3 AgNO3浓度的影响 由图3(a)可知，随着AgNO3浓度的增加，rGO-Ag在430 nm处的吸收峰值不断增加。但当浓度超过25 mmol/L时，增速减缓，可能是Ag+浓度过高，导致橙皮提取液中的还原剂大量消耗使其浓度降低。由图3(b)可知，当AgNO3浓度为5～25 mmol/L时，所得rGO-Ag的平均粒径均较为稳定地分布在240 nm附近。当AgNO3浓度为30 mmol/L时，rGO-Ag的平均粒径有显著增加，表明生成的AgNPs开始团聚。可能是当AgNO3浓度较低时，晶体生长速度受限[14]。随着AgNO3浓度的进一步增加，晶体生长速率增加，当其生长速度大于成核速度时，粒径逐渐增大[17]。此外，当 AgNO3浓度在5～10 mmol/L时，rGO-Ag溶液的Zeta电位绝对值变化不显著。而浓度进一步增加时，溶液的Zeta电位绝对值则显著降低。由此可知，AgNO3浓度过高会降低rGO-Ag溶液的稳定性。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果确定时间、温度、AgNO3浓度3个因素的4个水平，采用L16(45)的正交试验表头设计进行试验。因素水平设计如表1所示。以反应后得到的rGO-Ag平均粒径大小为考察指标，对正交试验结果进行直观分析和方差分析，所得结果分别见表2、3。由表2 可知，3个因素对rGO-Ag平均粒径的影响顺序为反应温度>反应时间>AgNO3浓度。此外，与代表了试验误差[18]的空白列极差值相比，反应时间、反应温度和AgNO3浓度3个因素均具有较高的极差值，表明3个因素的水平效应间存在差异。表3中的P值进一步验证了上述3个因素对rGO-Ag平均粒径大小的影响作用。因此，由正交试验结果得出制备rGO-Ag的最佳工艺条件为A4B4C3，即反应时间为4 h，反应温度为100 ℃，AgNO3浓度为25 mmol/L。在此条件下，所得rGO-Ag的平均粒径为249 nm。

大写字母不同表示Zeta电位绝对值差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示平均粒径差异显著(P<0.05)

图2 反应温度对rGO-Ag的影响

Figure 2 Effects of reaction temperature on rGO-Ag

表1 正交试验因素水平表

大写字母不同表示Zeta电位绝对值差异显著(P<0.05)；小写字母不同表示平均粒径差异显著(P<0.05)

图3 AgNO3浓度对rGO-Ag的影响

Figure 3 Effects of AgNO3concentrations on rGO-Ag

2.3 rGO-Ag的结构表征

采用TEM对GO、rGO和rGO-Ag的微观形貌进行表征。由图4(a)、(b)可知，GO表面平整、光滑，呈透明薄片状，而rGO透明度降低，褶皱增加，可能是橙皮提取液中的有机物附着其上所致。由图4(c)可观察到rGO-Ag片层的透明度降低，且表面附着了大量纳米尺寸的球形颗粒，表明AgNPs成功负载到rGO片层上。图4(d)是根据TEM图统计得出的rGO-Ag上负载AgNPs的粒径分布。结果显示，AgNPs的尺寸分布范围为3～50 nm，且有46.3%分布在10～20 nm，平均粒径为21 nm。

图5(a)所示的GO、rGO和rGO-Ag的Raman光谱可进一步揭示其结构变化。GO的2个特征峰D、G峰分别出现在1 344，1 593 cm-1。其中，G峰是由sp2杂化的碳原子振动产生，对应于布里渊区中心的E2g声子[19]。D峰为缺陷峰，由sp3杂化的碳原子振动产生，当石墨烯片层边缘的对称性被破坏或样品存在缺陷时便会出现。因此，D峰和G峰的强度比(ID/IG)值越大，表明石墨烯的氧化程度越大。由Raman光谱中二者的强度计算可得，GO、rGO和rGO-Ag的ID/IG值分别为0.88，0.84，0.75。由此表明，GO可被橙皮中的还原成分还原成rGO，结构对称性增加。而rGO-Ag的ID/IG值进一步减小，可能是由于纳米银粒子的吸附增加了电子碰撞[20]。此外，由于AgNPs的表面增强散射(SERS)，rGO-Ag样品中D和G带的峰强度显著增加[21]。

表2 正交试验设计与结果分析

表3 方差分析结果

图5(b)所示为橙皮提取液、rGO-Ag、GO和AgNPs的FTIR谱图。GO在1 621，1 724，1 000～1 368 cm-1处出现了特征吸收峰，分别对应于碳骨架上C═C键的伸缩振动峰、羧酸和羰基中的C═O伸缩振动峰，及C—O伸缩振动峰[22]。与GO相比，rGO-Ag谱图中含氧基团的吸收峰强度显著降低，说明其已被还原。且rGO-Ag在1 545，1 454 cm-1与AgNPs的特征吸收峰一致，进一步表明AgNPs已成功负载到rGO上。

图4 TEM图及rGO-Ag粒径分布图

图5 Raman图谱及红外吸收光谱

3 结论

本研究以澳橙果皮提取液作为还原剂及稳定剂，通过绿色还原法制备了rGO-Ag。单因素试验表明，延长反应时间、提高反应温度和适当增加AgNO3浓度均可提高AgNPs的反应率，降低其平均粒径。正交试验明确了rGO-Ag平均粒径的影响因素主次顺序为：反应温度>反应时间>AgNO3浓度，并确定了制备rGO-Ag的最佳工艺条件为反应时间4 h，反应温度100 ℃，AgNO3浓度25 mmol/L。在此工艺条件下，GO可被橙皮提取液还原，且片层上成功负载了粒径范围为3～50 nm AgNPs。后续研究可将制得的rGO-Ag用作抗菌纳米填料，添加到高分子基材中制备纳米抗菌包装材料。