2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的制备及抗菌活性研究

袁晓娴 乐 琳 姜启兴 刘晓丽 陈琬雯 夏文水 平 原

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122；3. 苏州丰倍生物科技有限公司，江苏 苏州 215000)

壳寡糖(COS)是一种来源广泛、无毒、溶解性好、具有抗菌性的多糖[1-2]，将壳寡糖应用于食品行业中，不仅可以抑制微生物的生长，延长食品保质期，还能够改善食品的质量[3-4]，但是壳寡糖的抗菌性较弱[5]，通过化学改性，将具有强抗菌性的物质接入壳寡糖中，可以进一步提高其抗菌性。有研究表明，将香叶醇[6]、曲酸[7-8]、富马酸[4]、富马酸单甲酯[9-10]等具有抗菌性的物质接入壳寡糖(壳聚糖)中，均能有效提高抗菌性。

壳寡糖上有3个改性位点，分别为C-2位氨基[11-13]、C-3位羟基[14]、C-6羟基[15]。有研究[16]表明，因为氨基具有一对强亲核性的孤对电子，其反应活性较羟基的高；壳寡糖的抗菌性有可能是由于C-2氨基的存在[15]，在酸性条件下，质子化的氨基带有正电荷，会与微生物细胞壁上的负电荷相互作用，从而影响微生物的生长代谢[2]；另由于C-3羟基存在空间位阻，C-6羟基的反应活性较C-3羟基高，因此本试验选定C-6位羟基为改性位点,保留其具有抗菌作用的氨基。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是GB 2760—2014允许的一种食品用香料，在水果保鲜中应用广泛，同时也可作为防腐剂延长食品保质期[17]。但2,4-D的毒性残留问题限制了其应用范围，对2,4-D衍生物、类似物进行研究和筛选得到具有2,4-D生物活性的物质，必将提高其在果蔬保鲜和农业生产中的应用范围[18]。黄丽[19]以2,4-D为囊芯，以明胶/壳寡糖/葡甘聚糖为壁材制备的复合微球具有良好的缓释性能，该复合微球可望在农业、医药、食品等行业得到应用。至今并未有研究涉及将2,4-D接入壳寡糖中并测定该种新物质的理化性质。本研究拟将2,4-二氯苯氧乙酸与壳寡糖反应，通过傅里叶红外、紫外可见吸收、1H核磁共振对终产物进行结构表征，所制备的新型食品添加剂2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯(Dcpo-O-COS)，以期提高壳寡糖的抗菌性，扩大壳寡糖在食品中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

壳寡糖：相对分子质量1.5 kDa，脱乙酰度90%，浙江金科药业有限公司；

2,4-二氯苯氧乙酸：97%，阿拉丁试剂有限公司；

甲烷磺酸、氯化亚砜、氨水、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙醇等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：江南大学食品学院生物技术中心微生物实验室。

1.1.2 主要仪器设备

水浴锅：DK-8AXX型，上海一恒科技有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

酸度计：FE20K型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

高速冷冻离心机：3K15型，德国Sigma公司；

傅里叶变换红外光谱仪: Nicolet NexuS470型，美国Nicolet Instrument Thermo公司；

紫外—可见分光光度计：UV-1000型，上海天美科学仪器有限公司；

全数字化核磁共振波谱仪：Brucker AV400 MHz型，德国布鲁克AXS有限公司；

X-射线衍射仪：D8Advanca型，德国布鲁克AXS有限公司；

热重分析仪：TGA2型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

恒温振荡器：THZ-D型，太仓市豪诚实验仪器制造有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂；

隔水式培养箱：GHP-9080N型，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路线 如图1所示。具体操作：

图1 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路线图

(1) 壳寡糖氨基的保护。保护壳寡糖上反应活性较高的氨基，以避免其参与反应。常见的壳寡糖氨基的保护方法有：Schiff碱法[8]、邻苯二甲酸酐保护法[20]、对甲基苯磺酸成盐法、甲磺酸保护法[21]等。本试验采用甲磺酸保护氨基，优点是在脱保护过程中不会对酯键造成影响。取0.02 mol的壳寡糖，在冰浴条件下溶解在30 mL甲烷磺酸中，反应30～60 min，使甲烷磺酸与壳寡糖的氨基形成甲烷磺酸盐，从而防止氨基参与后续反应。

(2) 2,4-二氯苯氧乙酸的羧基活化，以提高反应活性。采用酰氯化的方法来活化羧基[21]。取0.02 mol的2,4-二氯苯氧乙酸于圆底烧瓶中，再加入17 mL的SOCl2，60 ℃反应6 h，反应过程应注意严格控制干燥条件，防止水分进入发生水解，冷却至室温后，旋蒸除去未反应的SOCl2，得到的透明液体为2,4-二氯苯氧乙酰氯。

(3) 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯磺酸盐的制备。将壳寡糖甲烷磺酸盐逐滴加入2,4-二氯苯氧乙酰氯中，室温下反应4 h，-18 ℃贮藏过夜，加入过量丙酮，沉淀，11 000 r/min 离心5 min使固液分离，用丙酮洗涤上清液至无色，乙醇洗涤2次，得到产物2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯磺酸盐。

(4) 氨基脱保护。将2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯磺酸盐溶于一定量的去离子水中，用氨水调节溶液的pH至7.0，析出褐色沉淀，11 000 r/min离心5 min使固液分离，将沉淀用丙酮洗涤至上清液无色，乙醇抽提48 h以去除醇溶性杂质，真空干燥后得最终产品2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯(Dcpo-O-COS)。

1.2.2 结构表征及性质测定

(1) 傅里叶红外光谱：壳寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的红外光谱通过傅里叶变换红外光谱仪测定，采用溴化钾压片法测定，以溴化钾为背景，扫描范围为4 000～500 cm-1，分辨率为4 cm-1。

(2) 紫外可见吸收光谱：壳寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的紫外吸收光谱通过紫外—可见分光光度计测定，紫外分光光度计的狭缝宽度为2 nm。以去离子水为空白，测定壳寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的紫外全波长光谱。

(3)1H核磁共振图谱：样品的1H核磁共振图谱是由全数字化核磁共振波谱仪测定，壳寡糖的测定条件为：温度25 ℃，溶剂为重水；2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的测定条件为：温度60 ℃，溶剂为氘代DMSO。

(4) X射线衍射：样品的X射线衍射图谱的测定采用X射线衍射仪，扫描条件：X光管为陶瓷型，Cu靶，射线波长为0.154 nm，光管功率为2.2 kW，X射线发生器输出功率300 W，管压40 kV，电流50 mA，扫描温度25 ℃，扫描速度2°/min，扫描范围5°～60°。

(5) 热稳定性：由热分析仪器测定。检测条件为：N2流速20 mL/min，升温速率为20 ℃/min，加热温度范围为30～450 ℃。

(6) 抑菌性：菌种活化：挑取单一菌落于LB液体培养基中，30 ℃，180 r/min振荡培养12 h，吸取200 μL一代菌液于新的10 mL LB液体培养基中传代培养至OD600=0.5。菌液制备：将二代菌液进行梯度稀释，进行预试验选定稀释倍数。抑菌样品：以去离子水为溶剂，配置浓度为2.0 mg/mL的样品(壳寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯)溶液。抑菌性测定：以灭菌后的去离子水为空白，测定壳寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的抗菌性。吸取1.0 mL的抑菌样品及100 μL菌液至平板中，倒入40 ℃左右的琼脂培养基，混合均匀，冷却至凝固后，于隔水式培养箱中，37 ℃倒置培养24～48 h，观察平板中细菌的生长状况。

2 结果与分析

2.1 傅里叶红外光谱分析

如图2所示，壳寡糖的红外光谱中，3 400 cm-1附近的宽峰属于氨基及羟基；1 618，1 515，1 379 cm-1分别为壳寡糖的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰；1 069 cm-1为壳寡糖糖环骨架氧桥的伸缩振动[22-23]。2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的红外光谱中，出现了1 752，1 287，869，803 cm-1等新峰，其中1 752，1 287 cm-1为酯键的C═O吸收峰及C—O吸收峰；869，803 cm-1为苯环在1,2,4位有取代时的吸收峰；从红外可以初步判断目标产物的合成。

图2 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯及壳寡糖的红外光谱图

2.2 紫外可见吸收光谱分析

如图3所示，紫外光谱主要用于提供分子的芳香结构和共轭体系信息。壳寡糖本身并没有生色团，但残留乙酰氨基中的C═O会显示出吸收峰[24]。在壳寡糖的紫外光谱中，于190，280 nm左右有吸收峰。其中，190 nm 左右的吸收峰为壳寡糖氨基上的电子n→δ*跃迁的紫外吸收峰，而280 nm左右的吸收峰为C═O的R带吸收峰[25]18-19。在终产物Dcpo-O-COS的紫外吸收中，229 nm处属于芳香族化合物的B吸收带的吸收峰，200，283 nm处的吸收峰可归属为羰基结构的π→π*和n→δ*跃迁，此结果与红外结果一致，说明2,4-二氯苯氧乙酸成功接入壳寡糖。

图3 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯及壳寡糖的紫外—可见吸收光谱

2.3 1H核磁共振图谱分析

由图4可知δ=2.07处的吸收峰属于壳寡糖中未脱尽的乙酰基上—CH3的化学位移；δ=3.11处的吸收峰属于氨基葡萄糖残基上H的化学位移[26]；δ=3.37～4.05为壳寡糖的特征组峰，属于壳寡糖糖环上的氨基葡萄糖H和N-乙酰氨基葡萄糖残基上H的化学位移[27]；δ=4.70 处的吸收峰为溶剂峰。在2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的1H核磁图谱中，δ=2.49处的吸收峰属于溶剂峰；δ=4.95处的吸收峰属于与羰基相连的—CH2上氢的吸收峰；δ=6.88～7.62 处属于苯环上未被取代H的化学位移；核磁结果与红外结果一致，表明2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的成功合成。

图4 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯及壳寡糖的1H核磁共振图谱

2.4 X射线衍射图谱分析

由图5可知，壳寡糖有2个主要的衍射吸收峰，在2θ=13°和2θ=22°处，分别归属于壳寡糖分子的Ⅰ型和Ⅱ型晶型的特征吸收峰，X-射线衍射强度不大，说明结晶性能不强[25]21-22。经改性后的2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯出峰位置稍向左偏移，且峰强度明显增强，说明将2,4-二氯苯氧乙酸引入壳寡糖之后，改变了壳寡糖内部的结构，使其结构更加规整有序，结晶性能变强[28]。

图5 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯及壳寡糖的X-射线衍射图

2.5 热稳定性

图6(a)为热失重率曲线图(TG)，图6(b)为热失重率曲线图的一阶导数曲线图(DTG)。由图6可知，壳寡糖在30～450 ℃时存在2个失重阶段。一阶失重发生于70～150 ℃，失重率为7.5%，这一阶段的失重主要是由于分子中自由水和结晶水的蒸发导致；二阶失重发生于170～350 ℃，失重率为53.5%，最快降解速率的温度Tmax=224 ℃，这一阶段的热失重相对比较复杂，包含糖环类的脱水、解聚和烷基化单元的聚合物的分解等[25]22-23。

图6 2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯及壳寡糖的热重分析图

改性后的2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯在30～450 ℃时也存在2个失重阶段。其中一阶失重在60～132 ℃，失重率为4.4%；二阶失重在134～408 ℃，失重率为62.1%，最快降解速率的温度Tmax=279 ℃。由此可见，2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的热稳定性较壳寡糖有所提高，可能是引入2,4-二氯苯氧乙酸乙酸后，使衍生物较壳寡糖的结构和构象更为规整有序，从而使得2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的热稳定性提高。此结果与上述X射线衍射分析结果一致。

2.6 抑菌性

由表1可知，壳寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均表现出抗菌性，其中2,4-二氯苯氧乙酸>2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯>壳寡糖。2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性较壳寡糖均有所提高，可能是保留了壳寡糖具有抗菌作用的氨基，同时引入具有强抗菌作用的2,4-二氯苯氧乙酸。通过计算平均菌落总数可以得出，相对于壳寡糖，2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯对大肠杆菌的抗菌性提高了54.72%，对金黄色葡萄球菌的抗菌性提高了60.98%。

表1 样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用

3 结论

本试验提供了一种潜在的新型食品抗菌剂——2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯的合成路线，经过红外、紫外以及1H NMR对产物的结构进行鉴定，证明2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯合成成功，其结晶性、热稳定性及抗菌性较壳寡糖均有所提高，与对大肠杆菌抗菌作用相比，对金黄色葡萄球的抗菌作用提高得更为显著，2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯有望成为一种新型抗菌剂应用于食品行业中。

本研究中主要就新型物质的合成和表征进行了研究，但2,4-二氯苯氧乙酸壳寡糖酯针对细菌的抑制机理还未知，新型物质是否能够应用于食品中还需要进行相关的毒理性试验研究。