处理条件对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

朱秀灵 戴清源 王 枫 陶仁友 曹昕昕 许祚文 张志祥

(1. 安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000；2. 芜湖益然香木榨食用油有限公司，安徽 芜湖 241100)

芝麻素酚三糖苷是由三分子葡萄糖与一分子芝麻素酚以糖苷键连接而成，是芝麻饼粕中含量最高的一种水溶性木酚素[1-2]。与脂溶性木酚素如芝麻素、芝麻林素和芝麻素酚等相比，芝麻素酚三糖苷水溶性较好，体外抗氧化活性较弱[3-4]，但在体内肠道菌群及β-葡萄糖苷酶作用下可以转化为具有较强抗氧化活性的芝麻素酚及其他酚类化合物，能够降低机体氧化应激水平[2,5-6]，对机体健康发挥有益作用。

作为膳食成分，芝麻素酚三糖苷通常以脱皮或未脱皮芝麻籽、芝麻酱、芝麻芽菜等食物形式被人体摄入，在这些食物加工过程中，芝麻籽可能经过酸碱脱皮、高温焙炒、高压蒸煮、高温油炸、温控发芽等一种或多种处理，致使芝麻素酚三糖苷分子也不同程度地受到光、热、氧(空气)、酸、碱、酶及高压蒸汽的影响。目前已有研究[7]27-37[8]报道芝麻素酚三糖苷能被β-葡萄糖苷酶水解生成芝麻素酚，而对其他因素如光、热、氧、酸碱及高压蒸汽是否稳定，尚未见相关报道。本研究以实验室自制芝麻素酚三糖苷提取物为研究对象，探讨光、热、氧、酸、碱、酶及高压蒸汽处理对芝麻饼粕提取物中芝麻素酚三糖苷稳定性的影响，以期为进一步探讨芝麻素酚三糖苷在多因素作用下的稳定性和转化规律提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

芝麻饼粕：芜湖益然香木榨食用油有限公司；

α-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉，71 U/mg)、α-半乳糖苷酶(≥9 U/mg)、β-半乳糖苷酶(300 U/mg)：中国Sigma-Aldrich公司；

β-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉)：110 U/g，上海麦克林生化科技有限公司；

正己烷、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

芝麻素酚三糖苷标准品：HPLC纯度98%以上，实验室自制。

1.1.2 仪器与设备

鼓风干燥箱：ZFD-A5140型，上海智城分析仪器制造有限公司；

万能粉碎机：FW-100型，金坛市杰瑞尔电器有限公司；

往返式气浴恒温振荡器：SHA-S型，金坛市杰瑞尔电器有限公司；

台式低速大容量离心机：L-550型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；

多功能循环水真空泵：SHZ-Ⅲ型，郑州上街华科仪器厂；

液相色谱仪：LC-2010型，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芝麻素酚三糖苷提取物的制备 参照Zhu等[9]方法制备芝麻饼粕提取物，具体如下：将芝麻饼粕于50 ℃鼓风干燥6 h，万能粉碎机粉碎，过60目筛，按料液比1∶10(g/mL)加入正己烷，于气浴振荡器(120 r/min)中室温脱脂8 h，离心(4 500 r/min，10 min)，收集上清液，残渣以相同方式脱脂2次，上清液合并、减压蒸发，回收正己烷并得到芝麻油，残渣自然风干即为脱脂芝麻粕。称取一定质量的脱脂芝麻粕按料液比1∶10(g/mL)加入80%乙醇，于气浴振荡器(120 r/min)中室温浸提8 h，离心(4 500 r/m，10 min)，收集上清液，沉淀以相同方式浸提2次，将上清液合并、减压浓缩、真空干燥，即得到芝麻饼粕提取物。将芝麻饼粕提取物用蒸馏水溶解并配成浓度为10 mg/mL溶液，0.45 μm滤膜过滤，进行聚酰胺柱层析(3.0 cm×60 cm)，每次上样10 mL，蒸馏水洗脱，洗脱流速1.0 mL/min，洗脱液用自动部分收集器收集(10 mL/管)，高效液相色谱法检测洗脱液中芝麻素酚三葡萄糖苷，将含有芝麻素酚三糖苷组分的洗脱液合并，减压浓缩，真空干燥即得到芝麻素酚三糖苷提取物。

1.2.2 芝麻素酚三糖苷含量的测定 将芝麻素酚三糖苷提取物用80%乙醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法(HPLC)测定溶液中芝麻素酚三糖苷的含量[9]，色谱条件：色谱柱TSKgel ODS-80T(s) (4.6 mm×250 mm)，紫外检测器，检测波长290 nm，流速0.6 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL，每个样品检测时间30 min，流动相：A相为甲醇，B相为水，A相与B相体积比6∶4。

精确称取10 mg芝麻素酚三糖苷标准品，用80%乙醇溶解并定容至25 mL得到400 μg/mL标准品母液，用80%乙醇稀释分别得到浓度为5，20，40，80，100 μg/mL的标准溶液，高效液相色谱检测，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。按照保留时间是否与标准品一致对待测液中芝麻素酚三葡萄糖苷进行定性分析，根据峰面积，由标准曲线计算出待测液中芝麻素酚三糖苷的含量。芝麻素酚三糖苷提取物中芝麻素酚三糖苷的含量按式(1)计算。

(1)

式中：

ω——芝麻素酚三糖苷提取物中芝麻素酚三糖苷的含量，mg/g；

C——待测液中芝麻素酚三糖苷浓度，μg/mL；

V——待测液的体积，mL；

m——芝麻素酚三糖苷提取物的质量，mg。

1.2.3 光、热、氧(空气)对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

参照文献[10—11]报道的方法并加以修改，具体描述如下：准确称取30 mg芝麻素酚三糖苷提取物，用蒸馏水溶解并配成浓度为200 μg/mL溶液。等量量取该溶液各10 mL分别放入10个25 mL的带塞玻璃试管中，将其中8只试管用保鲜膜封口，分别放在试验台上、避光处、光照箱、水浴锅(设定温度100 ℃)中各2管，再将剩余的2管置于气浴振荡器中以200 r/min往复震荡，有利于样品与空气中的氧充分接触。其中，试验台、避光、光照箱及水浴试验，分别考察常规操作、暗光、光照操作及热处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响。将不同处理条件下的样品分别于8 h及24 h各取出1管，用高效液相色谱检测芝麻素酚三糖苷的含量，检测结果与0 h时芝麻素酚三糖苷含量进行比较，结果以芝麻素酚三糖苷的保存率表示。

1.2.4 盐酸对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响 参照文献[12]采用高浓度盐酸水解的方法，并加以修改，具体描述如下：准确称取10 mg芝麻素酚三糖苷提取物，按料液比1∶5(mg/mL)加入4.5 mol/L盐酸溶液，充分震荡。等量量取该溶液10 mL分别放到2个25 mL的带塞玻璃试管中并于37 ℃恒温水浴中分别酸解8 h和24 h，用2 mol/L NaOH溶液调节各样品pH至7.0(调节pH至中性，便于高效液相色谱检测)，记录溶液体积，用0.45 μm 滤膜分别过滤，进行高效液相色谱检测，检测结果与0 h时芝麻素酚三糖苷含量进行比较，结果以芝麻素酚三糖苷的保存率表示。

1.2.5 碱液(氢氧化钠)对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

参照文献[13]采用4.5 mol/L NaOH溶液处理芝麻素酚三糖苷溶液，具体方法描述如下：将10 mg芝麻素酚三糖苷提取物，按料液比1∶5(mg/mL)加入4.5 mol/L NaOH溶液，充分震荡。然后采用与盐酸处理相同的方法进行碱液处理。各样品经碱液处理后，用2 mol/L 盐酸调节pH至7.0，再用0.45 μm滤膜过滤，进行高效液相色谱检测，计算芝麻素酚三糖苷的保存率。

1.2.6 酶液处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响 采用pH 5.0醋酸缓冲溶液分别配制α-半乳糖苷酶[14]、β-半乳糖苷酶[15]、α-葡萄糖苷酶[16]和β-葡萄糖苷酶溶液[2]，各种酶液的终浓度均为2.0 mg/mL。将10 mg等量份的芝麻素酚三糖苷提取物分别加入到上述酶液(各50 mL)中，充分震荡使其溶解，等量量取各溶液10 mL 2份，分别放到2个25 mL的带塞玻璃试管中，于37 ℃恒温震荡酶解，各酶酶解时间分别为8，24 h，酶解结束将样品煮沸5 min钝化酶，冷却至室温，0.45 μm滤膜过滤，进行高效液相色谱检测，以各酶作用时间为0 h时的溶液作为对照，计算芝麻素酚三糖苷的保存率。

1.2.7 高压蒸汽处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

参照Xu等[17]报道的方法，并加以修改，具体如下：将10 mg 芝麻素酚三糖苷提取物按料液比1∶5 (mg/mL)加入蒸馏水溶解，其浓度为200 μg/mL溶液，等量量取10 mL 各3份置于25 mL 试管中，分别放入高压蒸汽灭菌锅中于1.01×105Pa、121 ℃处理30 min。将处理后的溶液用0.45 μm滤膜过滤，进行高效液相色谱检测，以未高压蒸汽处理的溶液作为对照，计算芝麻素酚三糖苷的保存率。

1.2.8 芝麻素酚三糖苷的稳定性评价 不同处理条件下芝麻素酚三糖苷的稳定性，可以根据高效液相色谱特征峰面积变化以及是否出现新的特征峰进行判断，在量变上表现为不同方法处理前后芝麻素酚三糖苷含量的变化即保存率不同。本研究以芝麻素酚三糖苷的保存率表示其稳定性，计算公式：

(2)

式中：

d——芝麻素酚三糖苷的保存率，%；

C0——不同方法处理前芝麻素酚三糖苷的含量，μg/mL；

C1——不同方法处理后芝麻素酚三糖苷的含量，μg/mL；

V0——不同方法处理前溶液的体积，mL；

V1——不同方法处理后溶液的体积，mL。

1.3 数据分析

试验均重复3次，结果以(平均值±标准偏差)表示。采用SPSS V22.0(IBM-SPSS, USA)软件对试验数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 芝麻素酚三糖苷标准曲线的绘制及含量测定

芝麻素酚三糖苷的标准曲线如图1所示，线性方程为Y=32.811 6X-7.613 5(R2=0.998 2)，线性范围5～100 μg/mL。

图1 芝麻素酚三糖苷标准曲线

根据线性方程计算得出脱脂芝麻饼粕中芝麻素酚三糖苷含量为(1.08±0.05) mg/g，80%乙醇提取物即芝麻饼粕提取物中芝麻素酚三糖苷含量为(3.16±0.11) mg/g，经聚酰胺柱层析初步纯化得到芝麻素酚三糖苷提取物，该提取物中芝麻素酚三糖苷含量为(476.11±7.52) mg/g。

2.2 光、热、氧(空气)对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

已有研究[18-19]报道，在芝麻籽加热焙炒、芝麻油精制操作如酸性粘土脱色或者酸性离子交换树脂催化作用下，芝麻林素可以转换为芝麻素酚，而芝麻素酚三糖苷在热处理条件下的稳定性未见报道。本研究中光、热、氧对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响，如图2所示。室温、避光、光照及水浴处理后，芝麻素酚三糖苷的保存率均在99.94%以上，处理方式及处理时间对芝麻素酚三糖苷保存率的影响不显著(P>0.05)，说明在本试验条件下，芝麻素酚三糖苷对光、热、氧(空气)非常稳定。

A、B、C、D分别表示室温、避光、光照及水浴处理

2.3 盐酸处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

如图3所示，盐酸处理时间由0 h增大至24 h，芝麻素酚三糖苷特征峰越来越小，当盐酸处理24 h时，芝麻素酚三糖苷特征峰最小，并且出现了化合物2和化合物3的特征峰。根据高效液相色谱图中芝麻素酚三糖苷对应的峰面积，以盐酸处理0 h时芝麻素酚三糖苷含量为对照，由式(1)、(2)分别计算得出盐酸处理8，24 h芝麻素酚三糖苷的保存率分别为23.85%和4.27%(见图9)，结果表明，高浓度盐酸处理导致芝麻素酚三糖苷结构不稳定，使其结构降解或转化为其他化合物，与文献[7]7报道不一致。文献[7]7报道，在酸性条件(pH 0.8～1.5，HCl)下芝麻素酚三糖苷无水解现象，而且除了3个新的色谱峰，并未检测到相应的芝麻素酚或者其他芝麻素酚糖苷化合物，据猜测，3个新的色谱峰可能是芝麻素酚的同分异构体。本研究中，芝麻素酚三糖苷经高浓度盐酸处理后产生2个新的特征峰，分别对应化合物2和化合物3，有待于进一步鉴定其化学结构。

a、b、c分别为处理0，8，24 h时溶液的高效液相色谱图；峰1为芝麻素酚三糖苷；峰2和3分别为新化合物

图3 盐酸处理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色谱图

Figure 3 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract with hydrochloric acid treatment

2.4 碱液(氢氧化钠)处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

由图4可以看出，芝麻素酚三糖苷经高浓度碱液处理未出现新的特征峰，随着碱液处理时间的延长芝麻素酚三糖苷特征峰面积随之增大，说明碱液处理对芝麻素酚三糖苷无破坏作用。根据峰面积大小，以碱液处理0 h时芝麻素酚三糖苷含量为对照，由式(1)、(2)分别计算得出碱液处理8，24 h时芝麻素酚三糖苷的保存率分别为118.31%和146.84%(见图9)。峰面积随着碱液处理时间延长不仅未减少反而增加，其原因可能是芝麻素酚三糖苷不纯，其提取物中非芝麻素酚三糖苷成分在高浓度碱液作用下发生转化，转化产物与芝麻素酚三糖苷有着相近的保留时间，峰面积增大可能是保留时间相近的多个组分叠加的结果。

2.5 酶处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响，如图5～9所示。

a、b、c分别为处理0，8，24 h时溶液的高效液相色谱图；峰1为芝麻素酚三糖苷

图4 碱液处理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色谱图

Figure 4 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract with alkali treatment

a、b、c分别为处理0，8，24 h时溶液的高效液相色谱图；峰1为芝麻素酚三糖苷

图5α-葡萄糖苷酶处理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色谱图

Figure 5 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withα-glucosidase treatment

由图5、9可以看出，α-葡萄糖苷酶处理前后，芝麻素酚三糖苷的特征峰相似，其含量无显著性变化(P>0.05)，保存率在8 h或24 h时均为99.92%以上，说明α-葡萄糖苷酶处理对芝麻素酚三糖苷的稳定性无显著性影响。由图6看出，β-葡萄糖苷酶作用于芝麻素酚三糖苷分子(化合物1)，随着作用时间延长，芝麻素酚三糖苷特征峰越来越小，而化合物2特征峰却随之增大，在24 h时，芝麻素酚三糖苷的保存率不足3.0%(见图9)，说明芝麻素酚三糖苷对β-葡萄糖苷酶不稳定。已有研究[2][7]32-33报道，芝麻素酚三糖苷可被β-葡萄糖苷酶水解转化为芝麻素酚，如果同时添加纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，芝麻木酚素糖苷类化合物水解得到的芝麻素酚更多。本研究中，β-葡萄糖苷酶对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响与现有报道一致。由图7～9可以看出，用α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶分别处理芝麻素酚三糖苷提取物，均能导致芝麻素酚三糖苷分子降解。当酶作用时间为8 h时，α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶处理溶液中芝麻素酚三糖苷特征峰变小，并且两种处理溶液均出现2个新的特征峰；延长酶作用时间至24 h，芝麻素酚三糖苷特征峰几乎消失，两种酶液处理后芝麻素酚三糖苷的保存率均小于5%，可能与α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的酶解作用导致芝麻素酚三糖苷分子降解或者转换为其他化合物有关，有待于进一步研究。

a、b、c分别为处理0，8，24 h时溶液的高效液相色谱图；峰1为芝麻素酚三糖苷；峰2为新化合物

图6β-葡萄糖苷酶处理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色谱图

Figure 6 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withβ-glucosidase treatment

a、b、c分别为处理0，8，24 h时溶液的高效液相色谱图；峰1为芝麻素酚三糖苷；峰2和3分别为新化合物

图7α-半乳糖苷酶处理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色谱图

Figure 7 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withα-galactosidase treatment

a、b、c分别为处理0，8，24 h时溶液的高效液相色谱图；峰1为芝麻素酚三糖苷；峰2、3和4分别为新化合物

图8β-半乳糖苷酶处理芝麻素酚三糖苷提取物的高效液相色谱图

Figure 8 HPLC chromatograms of sesaminol triglucoside extract withβ-galactosidase treatment

A、B、C、D、E、F分别表示盐酸、碱液、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶处理

图9 不同处理条件对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

Figure 9 Effect of different treatment on the stability of sesaminol triglucoside

2.6 高压蒸汽处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响

将芝麻素酚三糖苷水溶液置于高压蒸汽灭菌锅中，在121 ℃、1.01×105Pa下作用30 min，芝麻素酚三糖苷的高效液相色谱特征峰及峰面积大小无明显变化，其保存率约99.96%，说明芝麻素酚三糖苷在高压蒸汽作用下稳定性好。

3 结论

本研究主要探讨光、热、氧(空气)、酸、碱、酶及高温高压处理对芝麻素酚三糖苷稳定性的影响，结果发现，光、热、氧(空气)、碱液(氢氧化钠)、高温高压及α-葡萄糖苷酶处理对芝麻素酚三糖苷稳定性无显著性影响；盐酸、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶处理均可导致芝麻素酚三糖苷分子降解或转化为其他化合物，其稳定性随着作用时间延长显著性降低。

在食品加工过程中，芝麻素酚三糖苷结构稳定性会受到多种因素的影响，本研究虽探讨了单因素作用下芝麻素酚三糖苷的稳定性，但未对于不同因素不同水平及多因素作用下的稳定性及其降解和转化规律进行探讨，这些将在后期研究中深入探讨。