内脏脂肪素在大鼠结肠平滑肌收缩障碍中的作用及其机制研究*

张 灵 俞 汀 汤玉蓉 丁 雨 王 艳 林 琳

南京医科大学第一附属医院消化内科(210029)

研究发现肥胖与多种功能性胃肠病相关，肥胖者常存在胃肠动力障碍，可出现消化不良、便秘、腹胀等症状[1-4]，生活质量受到严重影响。胃肠道运动主要通过肠神经元、Cajal间质细胞与平滑肌细胞间的相互作用控制和调节，然而关于肥胖通过何种机制改变这些细胞间的相互作用，目前知之尚少。

脂肪组织的代谢和内分泌/旁分泌产物可发挥多种生物学效应，包括影响平滑肌的收缩性，如脂肪组织分泌的瘦素可抑制胃排空[5]，并能抑制血管[6]、子宫[7]平滑肌收缩。内脏脂肪素(visfatin, VF)是一种由内脏脂肪分泌的脂肪细胞因子，既往研究发现其可抑制子宫平滑肌收缩，作用强于瘦素，从而造成肥胖/代谢综合征孕妇宫缩无力[7]；此外，VF还可诱导主动脉平滑肌松弛[8]。然而，目前尚无研究报道VF对结肠平滑肌收缩的影响。肥胖患者血清VF水平显著高于正常人[9]，且常伴有结肠动力障碍[2]，因此推测VF可能在肥胖患者的结肠动力障碍中发挥一定作用。本研究旨在探讨VF对大鼠结肠平滑肌收缩的影响及其可能机制。

材料与方法

一、实验动物、主要试剂和仪器

8周龄SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠6只、12～14 日龄雄性SD乳大鼠60只(南京医科大学医药实验动物中心)。

VF、钙通道蛋白Cav1.2(α1亚基)抗体(OmnimAbs)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(Abcam plc.)；磷酸化和总肌球蛋白轻链(p-MLC、t-MLC)抗体(Cell Signaling Technology, Inc.)；FITC标记山羊抗小鼠IgG(Bioworld Technology, Inc.)；GAPDH抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术);钙离子荧光探针Fluo-3 AM(Thermo Fisher Scientific)；乙酰胆碱(ACh)(Sigma-Aldrich Co.)。ALC-M离体组织器官实验系统、MPA2000多道生物信号分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)；LSM 5 PASCAL激光共聚焦显微镜(德国蔡司)。

二、方法

1. 肌条收缩实验：以颈椎脱臼法处死SD大鼠，迅速剪取一段远端结肠(距肛门5～6 cm)[10]，制备成 0.3 cm×0.8 cm的肌条。将肌条浸没于37 ℃ Kreb’s缓冲液器官浴中，一端固定，另一端与离体组织器官实验系统的张力传感器相连，持续供给95% O2、5% CO2。每根肌条给予1 g预张力，平衡30 min，待肌条稳定，出现规律的自发收缩波后，使用多道生物信号分析系统记录加入溶剂(PBS)或VF(200 ng/mL)对肌条收缩活动的影响[11]。实验使用不同大鼠肌条重复6次。

2. 细胞培养和干预：12～14 日龄雄性SD乳大鼠处死后取远端结肠组织，以PBS反复冲洗，去除黏膜层和浆膜层，剪碎肌层组织，加入Ⅱ型胶原酶消化，经离心、重悬、过筛，将结肠平滑肌细胞均匀接种于培养皿中，于37 ℃、95% O2、5% CO2条件下以DMEM培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)培养。采用免疫荧光法进行细胞鉴定，α-SMA标记超过95%的细胞为平滑肌细胞[10]。待平滑肌细胞长至致密单层时进行传代。取对数生长的2～3代平滑肌细胞，以无血清DMEM培养基饥饿培养12 h后随机分为不同浓度VF处理组(50、100、200、300 ng/mL VF干预24 h)和不同时间处理组(200 ng/mL VF分别干预6、12、24、48 h)，同时设置不予任何处理的正常对照组和予溶剂(PBS)处理的溶剂对照组。

3. 蛋白质印迹法：各组平滑肌细胞以4 ℃预冷PBS洗涤2～3次，裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。将上清液移至1.5 mL EP管中，加入上样缓冲液混合均匀，沸水浴10 min变性。蛋白样品经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入p-MLC抗体(1∶500)、t-MLC抗体(1∶1 000)、Cav1.2(α1亚基)抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，ECL显影，凝胶成像系统拍照、分析。蛋白质条带灰度值以GAPDH为基准进行校正。

4. 平滑肌细胞内Ca2+浓度测定：各组平滑肌细胞加入Fluo-3 AM探针(5 μmol/L)，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤2次，再孵育30 min以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变为Fluo-3。弃去PBS，加入无钙 HBSS基础缓冲液或含钙 HBSS 缓冲液1 mL，立即于激光共聚焦显微镜下观察Ca2+负载情况，与Ca2+结合的Fluo-3激发波长为488 nm，发射波长为530 nm。选择合适的视野，滴入ACh(1×10-4mol/L)，动态监测细胞内荧光强度200 s。以加入ACh前后荧光强度的变化衡量胞内游离Ca2+浓度变化[12]。实验使用不同结肠平滑肌细胞重复3次。

三、统计学分析

结 果

一、VF干预对正常大鼠结肠平滑肌肌条收缩的影响

肌条收缩实验显示，加入溶剂后的SD大鼠结肠平滑肌肌条收缩张力与正常情况下无明显差异[(1.80±0.29) g对(1.97±0.45) g,P>0.05]，而经200 ng/mL VF干预的结肠平滑肌肌条收缩张力较溶剂对照组明显减弱，差异有统计学意义[(0.87±0.26) g对(1.80±0.29) g,P<0.05](图1)，提示VF可抑制结肠平滑肌收缩。

二、VF干预对结肠平滑肌细胞内MLC磷酸化水平的影响

图1 VF干预对正常大鼠结肠平滑肌肌条收缩的影响

蛋白质印迹法检测显示，正常对照组和溶剂对照组p-MLC表达水平相似(P>0.05)；与溶剂对照组相比，100、200、300 ng/mL VF干预24 h均可显著下调p-MLC表达(P均<0.05)，以200 ng/mL组下调最为明显(P<0.01)(图2A)，故200 ng/mL为最适干预浓度；与溶剂对照组相比，200 ng/mL VF干预6、12、24、48 h均可显著下调p-MLC表达(P均<0.05)，以24 h组和48 h组下调最为明显(P<0.001)，且两组间差异无统计学意义(P>0.05)(图2B)，故24 h为最适干预时间。

三、VF干预对结肠平滑肌细胞内 Ca2+浓度的影响

激光共聚焦显微镜观察显示，在细胞外有Ca2+的情况下，ACh刺激后正常对照组和溶剂对照组结肠平滑肌细胞内Ca2+浓度上升幅度无明显差异(P>0.05)，而经200 ng/mL VF干预的细胞内Ca2+浓度上升幅度明显低于溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(图3A、表1)，提示VF可抑制结肠平滑肌细胞内Ca2+浓度升高。在细胞外无Ca2+，即模拟阻断胞外Ca2+内流途径的情况下，ACh刺激后正常对照组Ca2+浓度上升幅度明显低于胞外有Ca2+时，差异有统计学意义(P<0.05)，但正常对照组、溶剂对照组和VF干预组间胞内Ca2+浓度上升幅度无明显差异(P>0.05)(图3B、表1)，提示VF直接抑制胞内Ca2+释放的作用并不明显，而可能主要通过减少胞外Ca2+内流抑制结肠平滑肌细胞内Ca2+浓度升高。

1 Da=0.992 1 u

A 细胞外有Ca2+

B 细胞外无Ca2+

图3 VF干预对结肠平滑肌细胞内 Ca2+浓度的影响

组别相对荧光强度峰值细胞外有Ca2+细胞外无Ca2+正常对照组1.65±0.171.42±0.05#溶剂对照组1.76±0.091.35±0.16VF干预组1.21±0.07**1.38±0.05

**与溶剂对照组比较，P<0.01；#与同组细胞外有Ca2+比较，P<0.05(实验重复3次)

四、VF干预对结肠平滑肌细胞Cav1.2通道表达的影响

蛋白质印迹法检测显示，正常对照组和溶剂对照组结肠平滑肌细胞Cav1.2(α1亚基)通道表达水平相似(P>0.05)；VF干预可呈剂量依赖性地抑制Cav1.2通道表达(P均<0.05)(图4)，提示VF抑制胞外Ca2+内流的作用与下调Cav1.2通道表达有关。

讨 论

VF是一个由473个氨基酸残基组成、相对分子质量为52 kDa的多肽，主要分布于脂肪组织中，同时也广泛存在于肝脏、肌肉、脑等部位，在人体中发挥多种生物学效应[13]。肥胖患者血清VF水平显著升高，且常伴有结肠动力障碍。既往研究表明VF可抑制子宫、血管平滑肌收缩[7-8]，关于其是否通过影响结肠平滑肌收缩参与肥胖状态下的结肠动力障碍，目前尚不清楚。本研究探讨了VF对结肠平滑肌收缩的影响，发现其可显著抑制正常SD大鼠结肠平滑肌肌条收缩，同时明显降低结肠平滑肌细胞内MLC磷酸化水平，提示VF系直接作用于结肠平滑肌细胞，抑制结肠平滑肌收缩。

目前关于VF抑制平滑肌收缩机制的研究很少。Yamawaki等[8]认为VF诱导血管平滑肌松弛的作用是内皮依赖性的，可能与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Akt磷酸化的改变有关。平滑肌细胞收缩与胞内Ca2+活动密切相关，ACh与M受体结合后，通过G蛋白耦联开放Ca2+通道，从而促使细胞外Ca2+内流，同时也可激活细胞内贮存的Ca2+释放，两者共同作用使胞内Ca2+浓度升高，进而通过钙调蛋白激活肌球蛋白轻链激酶，催化MLC磷酸化并引发平滑肌细胞收缩[14]。鉴于Ca2+在平滑肌细胞收缩中起至关重要的作用，本研究进一步探讨了VF干预对结肠平滑肌细胞内Ca2+浓度的影响。胞内Ca2+主要来源于胞内钙库的释放和胞外Ca2+内流，本研究发现VF干预可显著抑制由ACh引起的结肠平滑肌细胞内Ca2+浓度升高，并发现该作用主要是通过减少胞外Ca2+内流实现的。

1 Da=0.992 1 u

胞外Ca2+主要通过L型钙通道进入平滑肌细胞，L型钙通道包括Cav 1.1、1.2、1.3、1.4四种亚型，其中Cav1.2通道是胃肠道Ca2+流入引发平滑肌收缩的主要途径[15]。Cav1.2通道由α1、α2、δ、β四个亚基组成，其中α1亚基是构成通道孔道结构的主要跨膜亚单位，是决定通道性质的主要成分。本研究发现VF干预可剂量依赖性地抑制结肠平滑肌细胞Cav1.2通道(α1亚基)表达，VF可能通过下调Cav1.2通道表达抑制胞外Ca2+内流，进而引起胞内Ca2+浓度下降。

本研究分析了VF对正常大鼠结肠平滑肌收缩的作用，实验结果尚需在肥胖大鼠模型中进一步验证。此外，除对远端结肠收缩的影响外，VF对不同肠段平滑肌是否发挥同样作用亦有待进一步探讨。由于实验条件和技术的限制而未能进行Cav1.2通道活性检测，亦为本研究不足之一。在本实验结果的基础上对上述问题加以完善并作进一步研究，将能更好地阐明VF抑制平滑肌收缩的分子机制。

综上所述，VF可能通过下调结肠平滑肌细胞膜Cav1.2通道表达降低细胞内Ca2+浓度，引起结肠平滑肌收缩障碍。肥胖患者血清VF水平升高，可能参与了肥胖状态下结肠动力障碍的发生。有学者指出肥胖患者可通过控制饮食和规律运动降低血清VF水平[16]，而规律运动也是胃肠动力障碍(如便秘)患者的基础治疗之一，VF水平降低是否在其中发挥一定效应，有待进一步验证。