牛呼吸道疾病综合征病例的病原探析

周发勇

摘 要：为了解肉牛呼吸综合症（BRDC）对肉牛的致病性，对肉牛疾病预防进行指导。现场研究、临床症状和病理变化的分析、病理分离和病原体根据药物试验结果进行分析和处理。从该病例的肺组织中，分离到一种预防措施和一种兰科病原体。在PPLO固体生长基团上，观察到典型的“煎蛋状”的细菌滴。我们用PCR扩增了牛OPF基因的485个靶点。牛前体OPF的基因序列为美国分离株gp45核苷酸序列的98.4%。革兰氏阴性菌的生物学特性与内脏硫酸菌的生物学特性相一致。PCR扩增16S的rrn基因，扩增到14BP。结果，GenB库中记录的赖氏囊藻核苷酸的同源性为99.0%。这些分离物对大鼠有害。对牛的突起高度敏感，对青霉素、西西林、阿米卡星、青霉素、米尼西林敏感。结果表明，该综合病原菌是山谷真菌的主体。

某养牛场，从东北的一个牛场进口肉牛。疾病在被运回后三天就开始了病牛体温升高，咳嗽、喘息，伴有浆液性流涕、严重呼吸困难等呼吸道症状。有些牛还患有血液稀疏。18头牛在整个病程中死亡，造成严重的经济损失。为了解肉牛发病和死亡的原因，通过田间调查、临床症状和病理观察、病原分离鉴定和药敏试验，对肉牛发病和死亡的病原进行了分析。在此基础上，提出了综合防治措施。

一、材料与方法

1.材料

（1）从死牛的肺和肝组织中分离出无菌材料和实验动物。同时对肺组织进行无菌研磨，充分研磨少量PPLO支原体培养基。样品冷冻、解冻三次，在-20℃冰箱保存。2013年，广西兽医研究所细菌实验室分离鉴定并保存了支原体阳性对照GL-1。从广西医科大学实验动物中心购买昆明种小鼠18-20g。

（2）试剂和仪器兔血琼脂平板由广西兽医研究所细菌实验室制备。PPLO肉汤购自杭州贝斯特生物技术有限公司，TSA、TSB购自北京路桥科技有限公司，微生物生化反应管和药敏试验纸购自杭州天河微生物制剂有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增和克隆试剂w从北京康威世纪生物技术有限公司采购的低温台式离心机购自贝克曼公司，YY2Ⅲ-8B稳定稳定电泳仪购自北京61仪器厂;Pro Flex PCR系统购自生命科技公司;721BR09310型凝胶成像系统从Bio-Rad公司购买;孵化器从公司购买。

2.方法

（1）野外调查，观察临床症状和病理变化，询问发病情况，解剖死牛，肉眼观察器官形态。

（2）支原体1.2.2不孕症的分离、培养和形态学鉴定：将病牛肺组织切成研磨碗，加入3mL PPLO支原体培养基充分研磨，4000r/min离心10分钟，丢弃沉淀物，上清液经0.45μm过滤。一次性针头过滤器。滤液以1：10稀释液接种于PPLO支原体培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养72-96小时。观察。如果液体介质变色，则将线转移至PPLO固体介质。接种后，菌落在37℃和5%CO2培养箱中培养72～96小时。

（3）细菌的分离和鉴定：将肺和肝组织制成组织接触，固定，革兰氏染色，显微镜观察，取肺和肝组织分别接种在5%兔血琼脂平板、TSB平板和麦康凯琼脂平板上，按照俞雄标报道的方法进行培养。37℃，5%二氧化碳培养箱。24-48小时后，观察细菌生长，进一步取优势菌落。评价。

（4）生物降解特性试验方法进行了细菌分离的生物测定。该菌株的单个真菌落下，并进行生物测定。将0.2毫升单滴接种在微生物化学试管中，如乳糖、葡萄糖、甘蔗和芥末糖。在尿素等生物测定试管中，应用无菌液蜡，37～48小时。观察到冷却后的反应结果。

（5）细菌16SrRNA基因的PCR鉴定

通过接种环式无菌法，从肺组织分离到一个显性生长菌落，溶于10μL灭菌ddH 2 O 2。2μL菌液充分摇匀。采用细菌16S rRNA基因通用引物扩增细菌16S rRNA基因。PCR反应体系为50ugL：模板2ugL，上下游引物（10ugol/L）2ugL，2x Taq PCR母体混合物25ugL，在50ugL中加入ddH_2O。PCR反应条件为：95预变性5分钟，95预变性60秒，60退火72延伸60秒，共35个反应周期，72预变性10分钟。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经胶水回收后送北京华诺夫时代科技有限公司测序。用BLAST方法分析NCBI的核苷酸同源性。

二、结果与分析

1.现场调查、临床症状和病理变化

在引入的58头小牛中，38头生病，18头死亡。在疾病中，预防和己糖苷的治疗是无效的。发病率和死亡率分别为65.5%和22.4%。病牛体温高，咳嗽，呼吸困难，流鼻涕。在解剖学上，这种疾病仅限于肺部和胸部。心脏尖端的叶子、心脏和叶子都有每种红肉的退化。肺间质肿块增加。这个坏蛋的大小像黄奶酪和白奶酪。气管支气管内有大量白色牛奶泡沫。箱内有少量液体，一袋液体袋和液体黄色。

2.支原体的分离、培养及形态学鉴定

培养72h开始变色，变色培养基用0.22μm滤针过滤。将滤液接种到PPLO支原体液体和固体培养基中进行继代培养。结果表明，液体变色时间缩短。液体在24-48h内变色时间由红色变为褐色，培养基颜色均匀、澄清，无浑浊。在PPLO固体培养基上，可以观察到针尖大小的菌落生长48-96小时。在100x显微镜下，所有菜肴均出现典型的“煎蛋状”菌落。核心更厚，向下生长到中间。在它周围有一层透明的薄层。根据菌落形态特征，初步鉴定为牛支原体。

3.病原菌的分离结果

有少量的坚韧的革兰阴性菌在肺组织的组织染色后仍在正常肝组织中不可见。5%兔血琼脂平板和TEC板提高后，肝组织不分离细菌，中等大小，圆形，表面在肺组织的提高，湿滑的灰白色菌落。净化后，他们使用新鲜血液琼脂平板接种。在相同条件下，孵育24小时。根据研究结果，新鲜血液琼脂证明有没有黄色，中等大小，无细菌生长。这种真菌是透明、光滑、无溶血。A在室温下24小时后，在菌落中心观察到红色的色素。TSB组成长24小时浑浊和沉淀管底部的小点点。在兰兰染色检测，纯化后的菌株是革兰阴性菌。

4.株细菌生化特性的鉴定

根据生化特性试验方法进行生化鉴定。表明该分离物能分解葡萄糖、蔗糖、不水解尿素等。V-P试验阳性。该菌的生化特性符合粘质沙雷氏菌的基本生化特性。

5.药物敏感性试验和治疗结果

根據药敏试验结果，肉牛机体对有远见的犬毒、阿替西林、新卡尼林敏感，对真菌和青霉素敏感。对多合子细菌的B-和向下的尼西林VI不敏感。对青霉素、聚石灰B、利福库敏感。先锋六号和其他无反应物质。在家里，用100种毒液对一头有流泪、咳嗽和稀释症状的肉牛进行消毒，并对整头牛进行消毒，收集粪便并进行发酵。它是用5-7天的鹦鹉素和磨碎的半松树来对抗牛和牛的肌肉注射，并伴有流泪和咳嗽。对有扩张症状的牛进行滴注和强化治疗。注射3-5天的肌肉以防止其他肉牛。加强管理，增加多维微量元素，提高抗逆转。八天后所有的牛接受了治疗，疾病得到了控制，并且没有发现新的疾病例子。

三、结语

这些样品没有进行病毒检测。本实验室分离的牛支原体和粘质沙雷菌对大观霉素、阿奇霉素、阿米卡星、庆大霉素和新霉素高度敏感。采用大观霉素和地塞米松联合治疗该病，取得了良好的效果。最后，控制了疾病的发生，没有出现新的病例。由此可见，引起BRDC的病原体是支原体和粘质沙雷氏菌的混合感染。

参考文献：

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