3株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其基因分型

向文杰，林 俊，宋文凤，李德栋，薛 飞 ，朱远茂

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/ 大动物传染病研究室，黑龙江哈尔滨150069)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)的病原体，在血清学上常与羊边界病毒以及猪瘟病毒存在交叉反应。根据该病毒接种细胞后能否引起细胞病变(CPE)将BVDV 分为致细胞病变型(Cytopathogenic，CP)和非致细胞病变型(Noncytopathogenic，NCP)[1]，根据病毒5'UTR 区域基因的差异可将BVDV 分为牛病毒性腹泻病毒1 型(BVDV1)和2型(BVDV-2)[2]。不同的基因型依据5'UTR、Npro、E2基因序列的差异又可细分为不同的基因亚型，其中BVDV1 目前已经检测并定义了 22 个亚型(BVDV1a～BVDV1v)，BVDV-2 检测并定义了 4 个亚型(BVDV2a～BVDV2d)。我国主要流行BVDV-1型中的 1m、1n、1o、1p、1q、1u、1v[3-4]。BVDV 感染宿主后可以引起感染牛精神沉郁、流涎、黏膜糜烂、溃疡、肠炎、免疫抑制、产奶量下降，还可以引起怀孕的母牛流产、死胎以及畸形胎，如果胎儿存活则成为BVDV 持续感染牛(PI 牛)，PI 牛终生带毒并不断向外排毒。此外PI 母牛繁殖的后代一直是PI 牛，PI 公牛虽然能产生质量很好的精子，但是该精子是不育的。因此各国的BVDV 根除计划关键取决于PI 牛的检测和清除[5]。

CP 型和NCP 型BVDV 均可以引起牛急性感染，表现呼吸道、消化道症状或繁殖障碍，但NCP 型BVDV 主要引起牛持续性感染。为确定牛呼吸道传染病的病原以及BVDV 在临床健康牛群中是否存在持续性感染，本研究采集患呼吸道疾病犊牛鼻拭子及肺脏组织，同时采集临床健康的成年牛鼻拭子进行了BVDV 病毒分离，了解BVDV 在我国牛群中的流行株，并为其疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及临床样品 BVDV VEDEVAC株、BVDV p80 单克隆抗体(MAb) (B3)、MDBK 细胞以及牛鼻甲骨细胞(BT)均由本实验室保存；临床健康成年牛鼻拭子30 份样品采自内蒙古自治区某一牛场、患呼吸道疾病犊牛鼻拭子16 份及肺脏样品8 份采自黑龙江省某一牛场。

1.2 主要试剂 反转录酶、各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、pMD18-T 载体和 DL2000 DNA Marker 均购自TaKaRa 公司；基因提取试剂盒和小量质粒提取试剂盒均购自Axygen 公司；dNTP 和DNA 凝胶回收试剂盒均购自Thermo 公司；山羊抗鼠 IgG-FITC 购自Sigma 公司。

1.3 病毒的分离 将鼻拭子样品加入2 mL 含5 %小牛血清的MEM 培养液，充分震荡后挤压吸取浸出液，3 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液经0.22 μm 的滤器过滤除菌后备用。取肺部病料样品约1 cm3，剪碎，加入2 mL 含5 %小牛血清的MEM培养液后充分研磨，3 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液经0.22 μm 的滤器过滤除菌后备用。上述处理的样品接种于MDBK 细胞，37 ℃ 5 % CO2培养观察是否出现CPE，96 h 之后对无CPE 的样品盲传3 代，于-70 ℃保存待检测。

1.4 分离病毒的RT-PCR 检测及测序分析 取上述细胞培养物上清，提取基因组，利用本实验室设计并保存的BVDV Npro基因的引物(5'UTR-F：5'-C TAGCCATGCCCTTAGTAGGACTA-3'/BVDV1318R：5'-ATTGGTCTTCTCACTTGCATCCAT-3') 进 行 RTPCR 检测。94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min，预期扩增片段约1 200 bp。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品由哈尔滨博士生物公司测序，参照GenBank登录的已分型的BVDV 代表株相应序列，分析测得的Npro基因序列的部分5'UTR 的244 个碱基和 Npro的385 个碱基，并利用MEGA6.0 软件按Neighbor-Joining 法构建系统发育树，Bootstrap 值设定为1 000[6-7]。根据进化树结果确定BVDV 分离株的基因分型。

1.5 分离株的间接免疫荧光(IFA)鉴定 将1.4 检测的阳性分离株接种于96 孔细胞培养板中已长成单层的BT 细胞，同时设BVDV VEDEVAC 株为阳性对照，不接种细胞为阴性对照，72 h 后弃去细胞培养上清，PBS 洗涤后用4%的多聚甲醛室温固定20 min，以 BVDV p80 MAb (B3 腹水，1∶100)为一抗，山羊抗鼠IgG-FITC (1∶100)为二抗，进行IFA 检测。

1.6 分离株的TCID50的测定 将分离株10 倍倍比稀释，从10-1稀释至10-7，接种于BT 单层细胞，每个稀释度接种8 孔，120 h 后利用BVDV p80 MAb(B3 腹水，1∶100 倍稀释)进行IFA，以测定分离株滴度，主要检测10-4、10-5、10-6和10-7稀释度的病毒，根据荧光结果，按照Reed-Muench 法计算分离株的TCID50。

2 结果与讨论

2.1 病毒分离与RT-PCR 检测结果 鼻拭子及肺脏样品经MDBK 细胞接种培养后，利用BVDV Npro基因特异性引物进行RT-PCR 扩增，结果显示有3个样品扩增出与预期大小相符的特异性目的条带。将 3 个样品在 MDBK 中盲传 3 代后仍未观察到CPE。对盲传样品再次经RT-PCR 扩增BVDV Npro基因，结果显示3 个样品均扩增为阳性(图1)，且均为NCP 型，分别命名为480、A0583 和Lung-6。

图1 BVDV 分离株Npro 基因的RT-PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of BVDV Npro gene fragments from the 3 BVDV isolates by RT-PCR

2.2 分离株的IFA 鉴定及TCID50的测定结果 用BVDV p80 MAb 对 480、A0583 和 Lung-6 分别接种的细胞进行IFA 鉴定，结果显示BVDV p80 MAb 能够与480、A0583 和Lung-6 接种的细胞呈现特异性绿色荧光，阳性对照也呈现绿色荧光，而阴性对照无荧光(图2)。采用IFA 测定其病毒滴度，结果显示480、A0583 和Lung-6 株滴度分别为106.67TCID50/mL、107.00TCID50/mL 和 106.80TCID50/mL。

图2 4802、A0583 和 Lung-6 分离株的 IFA 鉴定Fig.2 The immunofluorescence reactivity of 480, A0583 and Lung-6 inoculated MDBK cells with monoclonal antibody to BVDV p80

2.3 分离株Npro基因序列分析及其分子进化树的构建 利用针对BVDV Npro基因特异性引物，3 株分离株均能扩增出与预期大小相符的特异性目的条带，对目的产物测序并进行BLAST 分析，结果表明3 株分离株均属于BVDV1 型。对3 株分离株之间进行 Npro基因序列比对分析显示，A0583 与Lung-6 的Npro基因序列一致性高达93.4 %；480 与A0583 Npro基因序列一致性为82.0 %，与Lung-6 基因序列一致性为81.5 %，一致性较低。为了明确3株病毒的基因亚型，从3 株分离株获得的Npro基因截取其 5'UTR 的 244 个碱基序列和 Npro的 385 个碱基序列分别构建分子进化树。5'UTR 系统发育树显示 480 株与 BVDV1c 亚型参考株 Shihezi148 株和AQMZ02AI21-2 株属于同一分支，表明 480 株为BVDV1c 亚型；A0583 株与TY05 株属于同一分支，Lung-6 与NX0801 株和ZM-95 株属于同一分支，但TY05 株、NX0801 株和 ZM-95 株均为 BVDV1m 亚型，所以A0583 和 Lung-6 均属于BVDV1m 亚型(图3A)。Npro 系统发育树显示480 株与BVDV1c 亚型参考株Shitara0105 株、519 株和DeerNZ1 株属于同一分支，表明 480 株为 BVDV1c 亚型；A0583 与TY05 株属于同一分支，Lung-6 与 TJ0801 株和ZM-95 株属于同一分支，而TY05 株、TJ0801 株和ZM-95 株均为 BVDV1m 亚型，因此 A0583 和Lung-6 均属于 BVDV1m 亚型(图 3B)，与 5'UTR 基因序列分型完全一致。

本研究共分离到3 株NCP 型的BVDV，其中480 和A0583 株是从不表现临床症状的牛鼻拭子中分离得到的。由于BVDV 不同基因亚型的抗原性有较大的差异，因此国内研发疫苗时如选用BVDV1a亚型极易导致免疫预防效果不佳或免疫失败。因此，国内研发BVDV 疫苗时应选用流行的主要亚型病毒株，以期取得令人满意的预防效果。值得注意的是本研究首次在内蒙古同一牛场分离到了BVDV1m 和BVDV1c 两个基因亚型，两种基因亚型同时存在对疫苗的研发和防控是极为不利的，应当引起足够的重视。本研究分离到了BVDV1m 和BVDV1c 基因亚型，这对进一步分析国内流行的不同基因型的BVDV 病毒株间的抗原相关性及对牛的致病性具有重要的意义，为BVDV 疫苗研制选择适合的流行株提供了物质基础。

图3 基于Neighbor-Joining 法构建BVDV 5'UTR 基因(244 bp) (A)和Npro 基因(385 bp) (B)核苷酸序列的遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on the BVDV 5'UTR (244 bp) (A) and Npro (385 bp) (B) gene sequences of 480, A0583,Lung-6 and BVDV reference strains